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PCR法鉴定T-DNA插入突变体T-DNA插入•T-DNA，转移DNA（transferredDNA)是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组•将目的基因转入到经过改造的T-DNA区，借农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株•除用于转基因以外，T-DNA插入到植物基因中能引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体•T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。鉴定原理BP:T-DNA载体上的插入片段的左边界序列通用引物（LB）LP、RP:用已知的被插入的基因的侧翼序列设计的特异性引物WT没有插入HZ杂合体HM纯合体鉴定原理鉴定原理本次实验材料：插入位点1100bp500bpExonIntronUTRpromoter提取植物基因组PCR反应鉴定实验安排•每2个人一个小组，每小组提1个样品•每行一个大组，另提1个对照WT•注意写好样品编号提取植物基因组实验安排（1）剪取约0.5-1cm2大小的幼嫩植物叶片，放入离心管中；（2）在液氮中，用研磨棒将叶片磨碎；（3）研磨结束后，向管中加入400uL的提取缓冲液，混匀；（4）室温，12000rpm离心3min；（5）吸取300uL上清液至一新的离心管中，加入300uL异丙醇，混匀；（6）室温，12000rpm离心5min；（7）倒掉上清，加入300uL70%乙醇；（8）室温，12000rpm离心3min；（9）倒掉上清，待管中液体晾干后，加入50uLddH2O溶解。提取植物基因组实验安排实验安排PCR反应鉴定•每小组做1管PCR反应(LP+RP+LB)•注意写好样品编号实验安排PCR反应鉴定成分用量(ul)primers0.5+0.5+0.52XTaqMix10ddH2O6template3total20Mix17ul94℃94℃55℃72℃72℃16℃3min30s30s1:0010:00∞32cycles•电泳检测Mix1:LP+RPMix2:LB+RP