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岛津液相色谱仪基础知识岛津企业管理（中国）有限公司分析仪器事业部分析中心岛津HPLC的历史Startedin1969196919721978198119821984199119972000200420102010GPC系统开发LC-1（LC-830）销售LC-3A系列销售LC-4A系列销售LC-5A系列销售LC-6A系列销售LC-10A系列销售LC-VP系列销售LC-2010销售LC-20AProminence销售LC-15C销售LC-30ANexera销售＜与DuPont签订许可合同后制造销售＞＜CDQR方式的单柱塞型送液单元为特征＞＜内置微型计算机的全自动HPLC＞＜世界上首创的微量型LC对应HPLC＞＜世界上最早的积木型HPLC、现在的HPLC的前身＞＜世界上最早采用微冲程送液单元和减低噪音技术的检测器＞＜采用有效性支持功能的积木型HPLC＞＜追求性能和操作性更加完善的一体型HPLC＞＜为分析实验室带来革新的HPLC＞＜为了让LC分析更为便捷＜130MPa耐压系统，低系统容量，高温分析和样品自动前处理＞在售产品岛津HPLC的历史20001997THECNLOGYBREAKTHROUGHFlexibleHPLCSystemwithMicro-strokeVolumeSolventDeliveryUnitTHECNLOGYBREAKTHROUGHLC-2010LC-VP20082004THECNLOGYBREAKTHROUGHTHECNLOGYBREAKTHROUGH2010THECNLOGYBREAKTHROUGH2010THECNLOGYBREAKTHROUGHLC-20AProminenceUFLCProminenceLC-15CEssentiaUHPLCLC-30ANexeraLC-20AProminence基础知识讲解内容1、色谱基础知识2、硬件基础知识3、定量基础知识4、维护基础知识第一部分色谱基础知识色谱起源石油醚色谱色素混合物碳酸钙颗粒分离组分色谱发展史20世纪初，俄国植物学家M.S.Tswett提出经典液相色谱法；20-30年代，柱分配色谱和纸色谱；50年代，气相色谱，薄层色谱；60年代，凝胶渗透色谱及高效液相色谱；70年代，高效毛细管气相色谱法；80年代，电色谱；90年代，光色谱。色谱定义色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术流动相：携带样品流过整个系统的流体固定相：静止不动的一相，色谱柱色谱是一种分离技术色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量EthylParabenPropylParabenMethylParabenButylParaben2.53.0mV50040030020010000.00.51.01.52.0min色谱分类高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)气相色谱GasChromatography(GC)薄层色谱Thin-LayerChromatography(TLC)毛细管电泳CapillaryElectrophoresis(CE)HPLCvsGC液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析流动相只起运载样品分子的能力HPLC简易流程图输液泵进样器柱温箱检测器色谱柱储液瓶数据处理系统HPLC特点分离性能好-9～10-12g）灵敏度高（10选择性高（同分异构，旋光异构）分析速度快进样量小（1-100μL）HPLC分类反相色谱（reversedphasechromatography）离子对色谱（ion-pairchromatography）正相色谱（normalphasechromatography）离子交换色谱（ionexchangechromatography）尺寸排阻色谱（GPC/GFC）反相色谱——流动相的极性大于固定相的极性C18(ODS)C8(octyl)C4(butyl)苯基TMS氰基非极性-O-Si(CH3)2-C18H37SiO2相互作用力是什么疏水性OHC18(ODS)SiO2强OH弱疏水性如果样品有–CH3CH2CH2–碳链作用力强芳香基如果样品有–COOH羧基–NH2氨基–OH羟基作用力弱反相色谱流动相的选择优化水相（缓冲液）和有机相的比例非常重要甲醇、乙腈和THF是常用的有机溶剂。在有缓冲液的情况下，缓冲液的浓度和pH值非常重要。流动相极性变化对分离的影响20%水30%水40%水1:2:3:4:对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯对羟基苯甲酸丁酯有机相:甲醇固定相极性变化对分离的影响C8SiO2C18(ODS)一般样品SiO2强样品C4SiO2弱样品固定相极性变化对分离的影响ODSC8TMS分析条件柱:Shim-packCLC-ODS流动相:MeOH:H2O=7:3流速:1.0mL/min温度:40℃进样体积:10μL检测器:UV-254nm色谱峰1.苯甲酸甲酯2.苯甲酸乙酯3.n-苯甲酸丙酯4.n-苯甲酸丁酯反相离子对色谱原理固定相流动相样品离子与流动相中离子对试剂的反离子生成疏水性离子对，而为反相色谱固定相保留。疏水性的苯乙烯/二乙烯基苯树脂或键合的硅胶水（缓冲液）+离子对试剂+有机溶剂所带电荷与待测离子相反离子对试剂常用离子对试剂阴离子化合物–氢氧化四丁基铵–溴化四丁基铵阳离子化合物–丁烷基磺酸钠–戊烷基磺酸钠–己烷基磺酸钠–庚烷基磺酸钠–辛烷基磺酸钠–癸烷基磺酸钠–十二烷基磺酸钠（C4）（C5）（C6）（C7）（C8）（C10）（SDS）反相离子对色谱流动相的选择离子对试剂的类型所带电荷与待测物质相反离子对试剂的浓度10-4~10-2mol/L在一定范围内，浓度越大，被分离物的保留值越大。流动相的pH反相离子对色谱应用有机酸、碱、盐的分离包括———————阴阳离子表面活性剂大分子脂肪酸烷基磺酸盐和芳香硫酸盐含氮化合物生物碱水溶性维生素酚类正相色谱——流动相的极性小于固定相的极性硅胶柱:氰基柱:氨基柱:二醇基柱:常用常用分析糖分析蛋白质-Si-CH2CH2CH2CNSiO2SiO2硅胶-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)化学键合相相互作用力是什么强SiOHSiOH弱非常弱OHHO氢键力氢键力如果样品有–COOH羧基–NH2氨基–OH羟基氢键力强如果样品没有任何官能团，如碳水化合物如果样品有大的基团,由于空间位阻氢键力弱正相模式下流动相的选择主要试剂烷烃（戊烷、己烷、庚烷、辛烷）芳香烃（苯、甲苯、二甲苯）二氯甲烷氯仿四氯化碳辅助试剂甲基-t-丁基醚(MTBE)，乙醚，四氢呋喃(THF)，二氧杂环乙烷，嘧啶，乙酸乙酯，乙腈，丙酮，异丙醇，乙醇，甲醇为了调整保留时间，可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂。流动相极性变化对分离的影响0%甲醇2%甲醇5%甲醇1:2:3:4:邻苯二甲酸二辛酯邻苯二甲酸二丁酯邻苯二甲酸二乙酯邻苯二甲酸二甲酯主要试剂:己烷反相色谱与正相色谱的对比反相色谱流动相极性大于固定相极性适用于能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物分离正相色谱流动相极性小于固定相极性适用于不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混合物的分离和制备HPLC反相色谱与正相色谱的对比反相–保留时间重现性好–固定相耐用正相–对立体异构体有很好的分离（VitaminE等）–保留时间重现性稍差离子交换色谱原理：利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离固定相：离子交换树脂流动相：水缓冲溶液（常用）或有机溶剂与水缓冲溶液的混合液离子交换色谱所用的缓冲液：阴离子分离：氢氧化物、硼酸盐、碳酸盐、酚盐和两性离子等阳离子分离：矿物酸，如硝酸、盐酸、硫酸和甲基磺酸等离子交换色谱作用力离子吸引力样品+++++++样品++++++R+RNR-SO3离子交换色谱应用生物领域（蛋白质、农药、氨基酸分析）离子分阳离子交换剂-）强阳离子交换剂（SCX）（R-SO3-）弱阳离子交换剂（WCX）（R-COO阴离子交换剂+）强阴离子交换剂（SAX）（R4N弱阴离子交换剂（WAX）（DEAE）尺寸排阻色谱法(SEC)原理：利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色谱方法。固定相：一种表面惰性、具有一定孔径的多孔凝胶应用：聚合物及生命科学领域SEC分类凝胶渗透色谱（GPC）主要用于聚合物领域以有机溶剂为流动相（氯仿，THF，DMF）常用固定相填料：苯乙烯－二乙烯基苯共聚物凝胶过滤色谱（GFC）主要用于生命科学领域以水溶液为流动相常用固定相填料：亲水性有机凝胶（葡聚糖，琼脂糖，聚丙烯酰胺等）GPC分离原理固定相是多孔填料，小分子样品可以进入孔径内部样品与固定相之间无作用力保留时间不同样品大填充物颗粒中小孔穴GPC分离原理排阻极限Log(MW)渗透极限V第二部分硬件基础知识HPLC简易流程图脱气机色谱柱进样器输液泵储液瓶柱温箱数据处理系统检测器储液瓶由机械性能和化学稳定性好的不锈钢、玻璃或聚四氟乙烯材料制成使用过程中储液瓶应适当密闭所有溶剂应先过滤，再装入储液瓶溶剂前处理-过滤过滤：0.45μm或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于DMF，THF，CHCl3等溶剂。再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。溶剂前处理-脱气脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动常用脱气方法超声脱气减压脱气在线脱气脱气机-在线真空脱气组成：脱气机主要由脱气管、真空室和真空泵组成。脱气管真空室到泵真空室内的脱气管由特殊的透析材料制成，当溶剂流经脱气管时，溶解在溶剂中的气体穿过管壁被脱出。储液瓶输液泵性能要求–能在高压下连续工作–输出流量范围宽–输出流量稳定、精确度、重复性高47岛津输液泵系列目的单元LC-20ATLC-15C流速范围0.001-10ml/min特性和应用非凡的耐用性，适于常量分析极低脉动，适于半微量LC和LC-MS分析极低脉动，适于半微量LC和LC-MS分析分析LC-20ADLC-30ALC-20AB0.0001-10ml/min0.0001-5ml/min0.0001-10ml/minLC-20AT选配件支架压力传感器泵头固定座泵头辅助进口单向阀主进口单向阀LC-20AT主泵头副泵头串联式柱塞往复泵单向阀LC-20AD选配件支架出口单向阀压力传感器泵头泵头固定座进液口泵头LC-20AD进口单向阀泵头单向阀并联式微体积柱塞往复泵LC-20AB压力传感器连接块出口单向阀泵头泵头固定座进口单向阀泵BLC-20AB进液口泵A柱塞往复泵结构示意图单向阀工作原理单向阀结构单向阀工作原理吸液冲程宝石球抛光面泵头球座进口单向阀出口单向阀排液冲程洗脱系统组成等度洗脱系统梯度洗脱系统｛高压梯度洗脱系统低压梯度洗脱系统等度B%B%梯度时间时间使用梯度洗脱的原因当采用等度洗脱时：MeOH/H2O=6/4分析时间长分离度差MeOH/H2O=8/2(column:ODS)使用梯度洗脱的原因当采用梯度洗脱时：95%甲醇浓度30%在最短时间内获得最佳的分离梯度洗脱要点梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度注意事项：溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）查看空白实验的数据遵守分析周期（最初的分析数据不采用）等度