质谱在单克隆抗体方面的应用

一、质谱的概念质谱简介二、质谱的特点质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器(Thompson)．但实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比(m/zorm/e)；质谱法应用范围广，可用于未知化合物的鉴定、定量分析、分子结构及化学特性的确定等方面；所需化合物的量非常低：10-12g,或10-15mole；对样品有破坏性；分析速度快；仪器结构复杂，价格昂贵，使用及维修比较困难。三、质谱的结构进样系统离子源质量分析器离子检测器A.气体扩散B.直接进样C.气相色谱A、磁式单聚焦分析器B、磁式双聚焦分析器C、四极杆分析器D、离子阱分析器E、飞行时间分析器F、傅立叶变换回旋共振分析器A.电子电离源EIB.化学电离源CIC.快原子轰击源FABD.电喷雾源ESIE.大气压化学电离源APCIF.场致电离源FIG.基质辅助激光解吸电离源MALDIA.电子倍增器B.闪烁计数器四、质谱联用技术色谱-质谱联用：质谱仪是一种很好的定性鉴定用仪器，对混合物的分离无能为力。色谱仪是一种很好的分离用仪器，但定性能力很差，二者结合起来，则能发挥各自专长，使分离和鉴定同时进行（色谱-质谱联用）。质谱-质谱联用：为了增加未知物分析的结构信息，增加分析的选择性，采用串联质谱法（质谱-质谱联用），也是目前质谱仪发展的一个方向。A、气相色谱－质谱（GC-MS）：应用十分广泛，从环境污染分析、食品香料分析鉴定到医疗检验分析、药物代谢研究等。而且GC-MS联用是国际奥委会进行兴奋剂药检的有力工具之一。B、液相色谱－质谱（LC-MS）：适用于热稳定性差、不易汽化的样品。C、毛细管电泳－质谱（CE-MS）：CE-MS是色质联用中新的发展方向，其中应用最成熟的是CZE*-MS。1、色谱-质谱联用2、质谱-质谱联用两个或更多的质谱连接在一起，成为串联质谱。最简单的串联质谱（MS/MS）由两个质谱串联而成，其中第一个质量分析器将离子预分离或加能量修饰，由第二个质量分析器分析结果。常见的形式有串联（多联）四级杆质谱、四级杆离子阱质谱、四级杆和磁质谱混合式串联质谱和采用多个扇形磁铁的串联磁质谱。特别适合于复杂组分体系且干扰严重的样品中低含量组分分析测定，具有比GC-MC和LC-MS等一级质谱更高的选择性和灵敏度。质谱与蛋白质对于蛋白质的“鉴定”，较早期的方法是利用Edmansequencing，或是二维凝胶电泳技术。但利用这些技术花费的时间较长；但从前质谱仅运用于小分子，因为在进行质谱分析时，必须将分子气化及带上电荷，对于较小的分子而言，并不是相当困难，然而对于大的生物分子（如蛋白质分子），要将分子气化及带电，同时不能伤害分子的完整性，非常不容易。1960~1980年，科学家发展出许多方式，尝试将生物大分子从液相游离化成为气相分子，例如比较早期的化学游离法、或是电浆游离法。但是这些方法只能应用到10kDa以內的分子，对于动辄数百至数千kDa的蛋白质大分子来说，仍不适用。日本科学家田中耕一(KoichiTanaka)1959年出生于日本富山县首府富山市，1983年获日本东北大学学士学位，现任职于京都市岛津制作所，为该公司研发工程师，分析测量事业部生命科学商务中心、生命科学研究所主任。他对化学的贡献类似于约翰·芬恩，因此也得到了1／4的奖金。（MALDI）美国科学家约翰·芬恩1917年出生于美国纽约市，1940年获耶鲁大学化学博士学位，1967年到1987年间任该大学教授，1987年起被聘为该大学名誉教授，自1994年起任弗吉尼亚联邦大学教授。他因为“发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法”和“发明了对生物大分子的质谱分析法”而获得今年诺贝尔化学奖1／4的奖金。（ESI)瑞士科学家库尔特·维特里希1938年生于瑞士阿尔贝格，1964年获瑞士巴塞尔大学无机化学博士学位，从1980年起担任瑞士苏黎世联邦高等理工学校的分子生物物理学教授，还任美国加利福尼亚州拉霍亚市斯克里普斯研究所客座教授。他因“发明了利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法”而获得2002年诺贝尔化学奖一半的奖金。2002年诺贝尔化学奖获得者表征研究项目方法一级结构分子量（完整分子、轻链及重链）LC/MS(Da）氨基酸序列肽段覆盖率、肽图，LC/MS/MS(%)脱酰胺/氧化肽图，LC/MS/MS(%)N末端焦谷氨酸环化比率（轻链、重链）肽图，LC/MS/MS(%)C末端测序及Lys缺失比率肽图，LC/MS/MS(%)二硫键定位非还原肽图，LC/MS/MS自由巯基定量Ellman’sTest(mol/mol)高级结构圆二色性圆二色谱（%）拉曼光谱荧光光谱核磁共振热稳定性DSC表征研究项目方法糖基化糖基化位点肽图，LC/MS/MS糖链结构分析LC/MS/MS寡糖图谱HILIC，荧光唾液酸含量HPLC糖化糖化硼酸亲和色谱电荷异质性pI及不同pI组分的相对含量cIEF电荷异构体分布CEX-HPLC(%)CZECZE(min)电荷异质体表征LC/MS/MS表征研究项目方法活性检测生物活性细胞法抗原亲和力/解离力ELISAKd,SPR,ForteBioOctet与含有表面抗原细胞的亲和力FACS(EC50μg/ml)FcγR亲和力FACS(EC50μg/ml)FcRn亲和力FACS(EC50μg/ml)C1q亲和力FACS(EC50μg/ml)CDCEC50ADCCEC50凋亡FACS产品相关杂质纯度，SEC-HPLC（%）单体纯度，高分子量杂质纯度，非还原CE-SDS低分子量杂质纯度，还原CE-SDS轻链+重链纯度，NGHC脱酰胺产物，RP-HPLCmol/mol,%工艺相关杂质HCP残留ELISAProteinA残留ELISADNA残留RealtimePCR生物负荷内毒素鲎试剂无菌薄膜过滤质谱与单克隆抗体质谱应用•N末端焦谷氨酸环化•链间二硫键位置的谷胱甘肽化•Fc段的唾液酸化•脱酰胺•糖化•链间二硫键的半胱氨酸化•天冬氨酸向琥珀酰亚胺的转变•Fc段的非糖基化•糖基变化•C端的赖氨酸变体和酰胺化一级结构电荷异质性糖基化•糖基化位点•糖链结构分析•分子量（完整分子、轻链及重链）•氨基酸序列•二硫键定位质谱与单克隆抗体应用一分子量测定单克隆抗体精确完整分子量测定图。TripleTOF®高分辨质谱在单克隆抗体药物完整分子量测定及轻重链分析中的应用单克隆抗体精确亚基分子量测定图。ESI-TOF蛋白质药物N端氨基酸序列可由肽谱结合二级质谱信息加以确认。序列末端肽段经反相色谱分离，通过质谱检测其精确分子量。母离子在质谱碰撞室中与惰性气体发生碰撞，得到的碎片离子质量包含肽段的序列信息，通过和理论序列信息比对，可确定单抗样品的轻链和重链N末端序列与理论序列是否一致。应用二N/C端氨基酸测序目前N末端序列分析大多采取Edman降解法，但Edman降解法不能解决N端封闭和蛋白质修饰的测序问题，而质谱法测序则不受限制。蛋白质的C末端分析，并不能采取类似N端氨基酸序列分析的化学分析。无论是国内要求，还是国外药典，现阶段都是采取质谱法对蛋白质样品的C末端序列分析。应用三肽段覆盖率两个批号次曲妥珠单抗LC/MS肽图镜像比较结果图。用Lys-C酶解后的肽段进行反相UPLC分离，通过与理论酶切肽段分子量比对，确定样品氨基酸序列与理论序列的一致性。液质联用（LC/MS）技术在曲妥珠单抗结构表征上的应用，HenryShion等，WatersCorporation应用四肽图CDR区定位亚基CDR区肽段标签酶解肽段质谱保留时间（min)UV保留时间（min）LCCDR1L:T2VTITCR比质谱保留时间提前约0.1minL:T3ASQDVNTAVAWYQQKPGK34.62CDR2L:T5LLIYSASFLYSGVPSR64.36CDR3L:T7SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTK71.18HCCDR1H:T3DTYIHWVR36.34CDR2H:T5GLEWVARH:T6IYPTNGYTR21.02H:T7YADSVK5.52H:T8GRCDR3H:T11AEDTAVYYCSR23.01H:T12WGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTK68.39应用五二硫键定位对于抗体大分子而言，其三维结构由四条肽链通过多个链间或链内二硫键连接形成，对其二硫键分析可进而了解其三级结构的情况，是其表征研究的重要内容。本研究先用NEM（N-乙基顺丁烯二酰亚胺）封闭样品的游离巯基，再经8MUrea变性处理后，用Lys-C和Trypsin依次酶切，得到第一组非还原待析样品（非还原样）。部分酶切样品再用还原剂TCEP还原，得到第二组待析样品（还原样）。单抗直接经胰蛋白酶酶解后，有些肽段仍然通过二硫键连接在一起，通过对二硫键连接肽段的鉴定可验证单抗的二硫键连接方式。重组嵌合抗CD20IgG1型单克隆抗体的结构验证，陶磊等，药学学报，2010，45（6）通过对液质肽图(图2)进行解析,共发现5种链内二硫键连接肽段:2种位于轻链(T2-T5;T9-T16),3种位于重链(T2-T9;T20-T26;T34-T39),由于单抗含有2条轻链和重链,因此对单抗10条二硫键的配对方式进行了验证。应用六糖基化位点单抗氨基酸序列中只有一个N-糖序列子结构(NST),位于重链肽段T23。在单抗切除糖链前、后所得液质肽图中,分别发现了含糖链的肽段T22-T23及不含糖链的肽段T23(图4),因此将糖基化位点定位于肽段T23中的Asn301。重组嵌合抗CD20IgG1型单克隆抗体的结构验证，陶磊等，药学学报，2010，45（6）通过将单克隆抗体用蛋白酶酶切，肽段经LC-MS分离检测，比较单抗切除糖链前、后的液质肽图，将上述可能发生的糖型设置为可变修饰进行数据检索，可以确认糖基化修饰位点。应用七糖链结构分析对于游离N-寡糖的分析，通过PNGaseF酶将单抗中的N-连寡糖释放出来，游离的寡糖先用2-AB（2-氨基苯甲酰胺）进行标记，然后再使用亲水作用色谱（HILIC）进行分离并使用荧光和串联四极杆飞行时间质谱进行检测。通过寡糖的准确分子量确认糖的类型。图A：UPLC/FLR/XevoQTofMS分析源自曲妥珠单抗的经2-AB标记的寡糖。左侧上图是FLR色谱图；左侧下图是MS的TIC（总离子流）图。液质联用（LC/MS）技术在曲妥珠单抗结构表征上的应用，HenryShion等，WatersCorporation应用八电荷异质体表征*毛细管区带电泳（CZE）毛细管区带电泳（capillaryzoneelectrophoresis）也被称为自由溶液电泳；主要用于分离带电化合物，不能分离中性化合物；主要以溶质的电荷/体积比的不同，因而迁移速度不同进行分离；带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。溶质的流出顺序：阳离子＞中性粒子＞阴离子；可用于分离单克隆抗体的电荷异构体。应用九液质联用法鉴定、定量宿主细胞蛋白细胞系表达出的蛋白，采用柱纯化，加入已知浓度外源蛋白用于验证方法正确性。第一维反相，第二维反相。Hi3蛋白定量方法是基于MSE串联质谱方法的非标定量蛋白技术。分析时首先使用2DnanoLC-MSMS液质平台以及Hi3方法对杂质蛋白进行鉴定及定量，进行方法开发，之后再使用1DUPLCMRM（多离子反应监测）方法进行大批量样品检测。应用十氢氘交换质谱氢氘交换质谱法是一种研究蛋白质空间构象的质谱。其原理是将蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氢原子将与重水的氘原子发生交换，而且蛋白质表面与重水密切接触的氢比位于蛋白质内部的或参与氢键形成的氢的交换速率快，进而通过质谱检测确定蛋白质空间结构信息。它在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用。