病毒包装及使用的常见问题

病毒包装及使用的常见问题1、问：关于病毒载体种类的选择的问题。从载体的毒性对实验的影响来说，是逆转录还是腺病毒好呢，还是其他病毒好？从操作的难度可行性来说是慢病毒要比腺病毒容易很多吗？答：操作难度上慢病毒与腺病毒都差不多,是指重组病毒的制备和纯化角度来说的，AAV的制备就更复杂更难一些。从载体毒性而言，慢病毒毒性较大，但它相对较少引起受体的免疫原性，而腺病毒则有较大的免疫原性。腺相关病毒载体是比较理想的基因治疗载体，免疫原性较低，而且对受体伤害较少。从插入目的基因角度考虑，慢病毒最大插入基因长度是5k，腺病毒最大插入基因长度是8k，腺相关病毒最大插入长度是3k。对大多数研究者来说病毒仅仅是一个基因转移工具，在自己的研究工作中只代表工作量，并没有值得大写特写的地方。因此，把这样的工作委托出去，就象把测序、合成引物等工作交给别人做一样。即便是委托出去，也要明白自己的实验目的和要求是什么，才能很好地选择，同时尽量节省经费。以腺病毒载体为例，可以这样选择：买穿梭质粒，自己做构建、鉴定和大提，交给公司做出毒、扩增和纯化和检测。根据自己的实验要求，可以选择精纯化，也可以选择粗纯化；条件好的可以选择自己做一部分检测。至于你的实验是选择腺病毒好，还是慢病毒或别的病毒载体好，主要还看你的实验目的，其次才是看哪那种病毒载体容易做。2、问：重组病毒产品如何运输和保存？答：病毒产品一般采取干冰运输。腺病毒及腺相关病毒也可以采用冰袋运输。避免重组病毒反复冻融，请酌情分装后于-80℃保存，建议不要在-20℃下长期保存。在我们提供的保存液中，病毒产品-80℃保存期为半年。建议保存6~12个月以上的样品，进行实验前，重新测一次滴度。病毒产品解冻后最好保持在冰浴中，并尽快使用。如果解冻后的病毒一时用不完，滴度足够高时，4℃可保存1~2周。但最好尽快用完，根据我们的经验，4℃放置1周，滴度会有4~5倍的下降。3、问：用于体内试验的重组病毒，是否要求纯化？答：是的，病毒纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的病毒外壳和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会引起宿主强烈的免疫反应。另外，纯化的作用还包括可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中等。4、问：病毒载体可以浓缩或稀释吗？方法如何？答：可以浓缩。对于一般实验室用户，可以采用高速离心办法浓缩。目前市面上的病毒浓缩纯化办法很多，有不少商业化产品。不同的病毒纯化办法不同。腺病毒载体可以用300K以下的浓缩离心管（PALL公司产品）进行浓缩。一般来说浓缩后的滴度以不超过3×1012v.p/ml为宜，过浓可能导致病毒聚集而产生沉淀。可以稀释：在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完。5、问：小鼠体内注射腺病毒，一只小鼠肌注大概多少量？体内表达时间和表达高峰如何？答：大部分文献显示，腺病毒用量范围在108-10IU/只小鼠。根据我们的经验，小鼠肌注腺病毒后，3~4天目的蛋白的表达达到高峰，一周后逐渐下降，持续表达时间在两周左右。6、问：腺病毒载体对小鼠的半致死剂量（LD50）大概是多少？答：据我们的经验，静脉注射小鼠（昆明鼠），半致死剂量LD50大约为1×1011v.p./只；裸鼠和SCID鼠可能更敏感一些。肌注方式的LD50未测到：1×1012v.p./只给药，未发现小鼠死亡7、问：VP，PFU，IFU的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？答：VP：病毒颗粒（viralparticle），是“活”（有感染性）和“死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。在体内实验中，它代表了进入肌体可能引起宿主针对腺病毒的免疫反应的腺病毒颗粒总量。测定方法是OD260法，只有经过纯化的腺病毒才能通过此方法测定VP/ml值。PFU：空斑形成单位（plaqueformationunit），是有感染性的“活”的腺病毒的总量，即腺病毒得活性单位。测定方法是将腺病毒样品经过一系列梯度稀释后，感染293细胞并培养，通过计算细胞病变空斑数得到腺病毒样品中PFU/ml值。IU：感染单位（infectiousunit），和PFU一样，是另一种腺病毒活性单位。测定方法是TCID50法。VP/PFU或VP/IU的值是判断腺病毒纯品中活病毒所占比例的重要依据。如果该病毒产品要用于人体实验，按中国生物制品质量要求，该比值应该在33以下。用于普通实验研究，该比值要求可以适当放宽。8、问：感染细胞最佳MOI的测定？答：MOI（MultiplicityofInfection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。对于分裂活跃的细胞，比如HeLa、293细胞，MOI=1时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。我们建议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），选择适合的MOI进行实验（可以考虑选用携带报告基因的病毒，比如Lenti-EGFP）。9、如何保证病毒包装实验室安全？答：病毒载体已经被全世界许多实验室应用，没有出现过任何意外，但仍具有潜在的产生复制型病毒（RCL）和致癌的风险，操作者在实验中仍需要保持高度警惕！所有操作均应尽量在BSL2级生物安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域，避免产生气溶胶，tip头一定要选择带有滤芯的。必须高度注意被污染的尖锐物品，包括针头、注射器、载玻片、移液管、毛细玻璃吸管和解剖刀。每次实验后，立即清理所有接触过病毒的器具，均应高压消毒再进行下一步处理。显微镜台、生物安全柜台面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外洒落的含病毒的液体，用卫生纸吸干后，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h。装盛病毒载体的实验用品，要单独放置，标示清楚，并标注“危险品”字样。尽量使用培养瓶，不要使用培养板来感染病毒，以防意外洒落。对共用实验室的人员进行病毒安全培训或提示10、慢病毒滴度检验办法答：常用的有核心蛋白定量法、RNA基因组定量法、DNA基因组定量法、流式细胞计数法、生物学滴度法、抗性克隆筛选法。11、关于病毒载体安全性问题问：病毒载体安全性有些问题，你对此是怎么看待，如何解决？比如：免疫原性问题答：病毒载体的安全性是业界一直关心的问题。尽管病毒载体都删去了致病基因，但病毒在包装过程中会发生基因重组，存在致病风险性。该问题需要更多的实验进行验证。病毒载体的免疫原性各不相同。关键在于如何使用载体，应针对不同疾病选用不同载体。比如腺病毒载体的免疫原性很强，一般用于治疗肿瘤和用做疫苗载体。这时其免疫原性并不是什么缺点，反而还有好处，起到免疫佐剂的作用。反转录病毒载体和AAV病毒载体的免疫原性很弱，用于需要长期表达和忌讳引起免疫反应的情况，比如自身免疫性疾病。12、病毒载体的开发和利用问题问：病毒载体靶向性强，且能稳定的在体内表达，现被认为最有开发价值的转导系统，但是安全性受到质疑，载体本身也受到一定的限制。如何开发和利用病毒载体？答：病毒载体是一个工具，一般的研究者的主要精力应该用在挖金矿上，而不是制造工具上。目前国内也存在专门研究不同病毒载体的机构，专门为研究者制备载体。对于专门研究载体的研究者而言，载体的靶向性、容量和安全性都是热点。靶向性研究的热点主要也集中在这两方面：①对病毒的外壳蛋白基因进行改造，主要是在基因的某些位点插入特定短肽。依靠这些短肽来改变对细胞的亲嗜性。②用不同血清型的病毒做载体。如AAV有9种不同的血清型。13、腺相关病毒载体是不是只要能转入细胞就可以整合到宿主细胞基因组中？如果不是，那么整合率大概有多少？是不是跟靶细胞类型有关呢？答：野生型AAV病毒感染细胞后倾向于整合到19号染色体的AAVS1位点。这个特性是与其rep基因功能和ITR结构以及染色体特定位置的序列相关的．AAV载体是经过改造的，已经去除了其repcap基因，因此已经失去了特异整合的特性。对于不同的靶细胞，AAV载体的整合几率是不同的。越来越多的研究发现，在许多组织中AAV载体进入细胞后并不整合，而以附加子（episome）形式存在，最为典型的是在肌肉中。也有些研究报道AAV载体的整合是相对随机的，有整合到活跃的基因中的倾向。14、病毒载体对目的基因的长度是否有要求？答：有AAV的总包装容量是4.7kb，载体中ITRs（两个ITR共290bp）+hCMV（约750bp）+polyA（约150bp）约1200bp，所以如果用AAV包装载体，目的基因长度要求不超过3.5kb。相对应慢病毒目的基因长度不超过5kb，腺病毒载体目的基因长度要求不超过8kb。15、我的试验需要多少总量的AAV载体？答：AAV介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分。根据我们的经验需要AAV的病毒量总量约为5×1012v.g.（一般AAV动物实验低、中、高剂量组用药量分别为1011、1012、1013v.g./kg左右）。16、据说AAV在细胞上的表达远比不上在动物体内的表达，为什么？答：AAV载体在体外实验中用于转导培养细胞时，常发现其表达水平较低，而且有表达延迟现象。这是因为AAV基因组是单链的，它进入细胞以后，必须要有一个由单链变为双链的过程，然后其所携带的外源基因才能进行转录和翻译，在没有辅助病毒或其它辅助因子的情况下，这种AAV由单链DNA在细胞内复制形成双链DNA的过程是十分缓慢的，因此相对于其它双链DNA病毒载体如单纯疱疹病毒（HSV）和腺病毒（Ad），其表达明显延后。此外，AAV对细胞毒性低，培养的细胞在加入AAV后，细胞分裂生长能力不受太大的影响，这样也对AAV载体有一种稀释作用，也导致其表观表达水平较低。而在体内应用时，注射部位的组织细胞通常没有显著增殖，不会出现AAV载体被稀释的情况，而且在体内各种促进AAV载体所携带外源基因表达的各种因子相对丰富，故体内应用时，AAV载体的表达水平比较高。研究表明辅助病毒或其它辅助因子可以明显促进单链DNA复制成双链DNA，从而明显提高外源基因的表达水平，故在体外应用可以考虑加入辅助病毒（Ad5）或丁酸钠（终浓度10~50mmol/L），这样可以提高表达水平达5~10倍。17、如何才能用重组病毒载体在细胞上做出满意的结果？答：病毒载体在细胞试验中要想取得满意的结果，主要在以下几个方面：①病毒载体在不同的细胞由于细胞表面受体的差异而不同转导效率不同，尽量选择转导效率高的细胞，可用参考文献报道和转导报告基因进行筛选。②良好的细胞状态。③最好在细胞状态最佳时感染病毒。特别是不要在消化细胞后不久就感染，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏，应该培养过夜后再感染病毒，效果较好。④适当的转导MOI（病毒基因组数/细胞的比），一般可用105上下做倍比稀释。⑤适当的转导体积，如24孔板可用200ul，6孔板0.5ml。⑥转导时间为1-2h，每25分钟晃动培养板混匀一次。（转导时，最好换用无血清培养基，因为血清对病毒的感染有些许不利影响）⑦可加合适辅助药物刺激，增强表达。⑧适当表达检测时间，如是分泌蛋白可每24h连续取培养上清检测。通常蛋白表达量在几百纳克至几微克/ml水平。18、如何才能用病毒载体在动物体内做出满意的结果？答：病毒载体在动物试验中要想取得满意的结果，主要注意以下几个方面：①选择适当的血清型：例如不同的AAV血清型在动物体内同一组织有不同的转导效率，如AAV1在肌肉组织中、AAV5在肺组织中有很高的转导效率。②选择适当的靶器官：同一血清型AAV在不同的组织具有不同的转导效率，尽量选择转导效率高的靶器官。③转导途径：尽量选择局部直接多点注射靶器官。④转导病毒量：根据我们的经验，所加病毒量太多表达量反而会降低。⑤检测时间：根据我们的经验不同基因的表达高峰时间是不同的，一般在2周可检测到基因表达，如无抗体产生的影响，基