单克隆抗体和基因工程抗体

工程抗体EngineeringantibodyEmilvonBehring,1901,antitoxinsGeoregesKohlerandCesarMilstein,1984,monoclonalantibodySusumuTonegama,1987,structureofIggeneGeraldEdelmanandRodneyPorter,1972,structureofantibodyPaulEhrlich,1908,productionofantibodyNobelPrizewinners免疫球蛋白的功能抗体介导的调理作用NK细胞介导的ADCC作用一、抗体分子的结构二、细胞工程抗体和基因工程抗体三、治疗性单抗研制进展一抗体分子结构免疫球蛋白分的基本结构免疫球蛋白的水解片段免疫球蛋白的功能区complimentaritydeterminingregion,CDRhypervaribleregion(HVR)(complimentaritydeterminingregion,CDR):formationoftheAgbindingsitepurple:HVCDR(inboththeribbonandballandstickviews)green:antigenHVsequencescontacttheantigen.antibodyantigenantigen-antibodycomplex:epitopeRepresentationofthedisassociationofanantibody(top)andantigen(botton)molecule.CDREpitope重链的基因结构：(a)鼠(b)人二、细胞工程抗体和基因工程抗体第一代：多克隆抗血清第二代：细胞工程抗体第三代：基因工程抗体抗体技术的发展经历了三个阶段1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。1937年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、甲种（α）球蛋白、乙种（β）球蛋白、丙种（γ）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。1975年KöhlerandMilstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体(monoclonalantibody,MAb)。1994年基因工程抗体。1、多克隆抗体(polyclonalantibody;PcAb)对健康人用疫苗进行主动免疫，免疫前（a）和免疫后10天（b）分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的g球蛋白条带较宽，免疫之后则相对集中。Bruton氏病患者血清蛋白中的球蛋白条带缺失（c）。a1a2b白蛋白球蛋白（c）（a）（b）PcAb的制备多价抗原单克隆（致敏的B细胞）单克隆抗体实际意义：（1）预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清抗破伤风，胎盘球蛋白抗病毒感染等，副作用：超敏反应。（2）临床诊断，如：肥达氏反应---伤寒、副伤寒，缺点：特异性差。2、单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。特点：具有高度均一性。杂交瘤细胞：骨髓瘤细胞---无限增殖；免疫B细胞---合成、分泌特异性抗体。杂交瘤技术---HAT培养基：次黄嘌(H),氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。单抗制备的流程图实际意义：（1）抗原的纯化和结构分析；（2）细胞发生、分化及功能的阐明；（3）临床疾病的诊断和治疗，如：免疫分子检测；免疫导向药物治疗恶性肿瘤---McAb抗癌药物(毒素或放射核素偶联)。多克隆抗体单克隆抗体来源动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群多为鼠源性特点来源广泛、制备容易纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应、制备成本低组成针对不同抗原表位的抗体的混合物针对单一表位，结构和组成高度均一，抗原特异性及同种型一致应用疾病的被动免疫治疗疾病诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向药物制备缺点特异性不高、易发生交叉反应，不易大量制备人体应用后可导致人鼠抗体反应多克隆抗体与单克隆抗体的比较3、基因工程抗体（geneticengineeringantibody）通过基因重组改良抗体性能通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体Generatinghumanantibodieswhichcouldneverbeobtainedfromthebloodstream.Byrandomordesignedmutations,affinityorspecificityoftheantigenbindingcanbechanged,301小分子抗体3鼠单抗人源化基因工程改造的抗体2(1)小分子抗体123免疫球蛋白基因载体的构建H链表达载体L链表达载体共转染细胞PrVHCH1PrVLCLFab抗体分子的制备IFabantibodymolecule抗体分泌细胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗体分子的制备IIFvantibodymolecule分别构建载体L链表达载体H链表达载体共转染细胞PrVHPrVLFv[二硫键稳定的Fv(disulfide-stabilizedFv,ds-Fv)]小分子抗体的制备(1)ds-Fv抗体分泌细胞VHVL-S-S-Fv小分子抗体的制备disulfide-stabilizedFv,ds-FvIIIDiabodystructure双特异性抗体抗原A抗原B-S-S-FabVHCH1VL-S-S-CH1VHVLFvVHVLCTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原A抗原B(2)抗体融合蛋白抗原结合部位与生物活性蛋白结合免疫导向免疫桥连嵌合受体含Fc段的抗体融合蛋白—免疫黏附素Fc的作用：检测、纯化、延长血清中半寿期生物学效应功能FcproteinSPAthrombinFc的作用：检测、纯化、G-CSFFcFusionProteinDNAligationexpressionFc的作用：延长血清中半寿期(3)鼠单抗人源化●恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体●可变区人源化——人改型抗体●用抗体库技术进行人源化鼠单抗人源化嵌合抗体（chimericantibody）:在基因水平上将小鼠的Ig可变区与人的Ig恒定区嵌合在一起，所产生的抗体含有70-80%的人Ig分子的序列，在很大程度上减少了单克隆抗体的免疫原性，但这种抗体尚存20-30%的鼠源成分，在实际应用过程中仍可刺激机体产生较强的抗独特型反应。人-鼠嵌合抗体嵌合抗体技术人---鼠嵌合抗体就是用人源性抗体的一部分代替鼠源性抗体的一部分，使之保留对抗原的特异性，又具备与补体和细胞结合的功能，并减少异源性蛋白的抗原性。研究人员设想，用人源性基因代替鼠源性抗体基因中的Fc区。因为Fc区的主要功能是激活机体免疫反应，也是产生人抗鼠反应的部分。研究人员利用编码人抗体Fc区的DNA片段替换鼠源性的Fc段DNA。Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因载体的构建H链嵌合载体L链嵌合载体共转染细胞启动子人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体MabTheraforthetreatmentofnon-Hodgkin-lymphomasMalignantB-cellsaredestroyedafterdockingofMabThera鼠单克隆抗体V区的人源化人改型抗体（CDR移植）人源化抗体（humanizedantibody）又称CDR移植抗体（CDRgraftingantibody）改型抗体技术嵌合抗体由鼠可变区与人稳定区组合而成，因而仍有一定的免疫原性。为降低来自小鼠可变区中骨架区的免疫原性，Winter等克隆出鼠源抗体中与抗原结合的三个互补决定区（CDR）基因用以置换人抗体中相应序列。由于这种抗体绝大部分为人源性，只有CDR区来自小鼠，因而称为CDR移植抗体（CDRgraftedantibody）。这种抗体在人体内免疫性大为降低CDR序列CDR序列鼠单克隆抗体人抗体人源化抗体图4鼠单克隆V区人源化（CDR移植）抗体库技术u抗体库——在原核系统功能性表达多样性抗体基因(repertoire)u通过多种选择手段筛选出特定性能的抗体基因三基因工程方法研制新的单抗抗体库技术产生的三项技术基础RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达噬菌体展示技术（phagedisplay)噬菌体抗体库技术将从人或小鼠B淋巴细胞中分离的mRNA逆转录成cDNA，用PCR扩增编码轻链和重链的cDNA；然后用限制性内切酶酶解扩增的cDNA片段，克隆到丝状噬菌体质粒载体中，与丝状噬菌体蛋白Ⅲ基因连接成融合基因，经辅助噬菌体感染大肠杆菌后，携带有表达载体的大肠杆菌就会释放外壳上带有抗体片段的噬菌体；再用ELISA或免疫亲和层析法即可筛选出特异性抗体。接头DNAVHVL噬菌体表面呈现的小分子抗体基因III或基因VIII外壳蛋白VHVL噬菌体抗体图示抗体库的构建抗体库的富集筛选抗体库技术的应用●人源抗体的制备●抗体性能的改良●不经免疫制备抗体四抗体药物的临床应用抗血清单克隆抗体基因工程抗体破伤风抗血清抗肿瘤(鼠,人-鼠)抗肿瘤,自身免疫病Theriseofantibody-basedtherapeuticsfurtherillustratesthesubstantialchangeintheparadigmsofpharmaceuticaldevelopment,Byutilizingthebody'sowncapabilitiesasasourceforadrugratherthanthechemistsreagentsvessel.急性感染(diphtheria,tetanus,measles,rabies,etc.),中毒(insects,reptiles,botulism),预防措施(hypogammaglobulinemia).破伤风抗毒素(马血清)异源Heterologous同源Homologous人工被动免疫人工注射人的球蛋白（gamma-globulins）或免疫动物的球蛋白。I抗血清usedtopreventand/ortreatawidevarietyofdiseases,HumanAntibodiesProducedinClonedCalvesProductionofunlimitedquantitiesofhumanpolyclonalantibodiesagainstanydiseaseagentCloningtechniquetoproducefourcalvesexpressingahumanchromosomefragmentcodingforarangeofhumanantibodies.humanchromosomefragmentcontainingtheun-rearrangedsequencesoftwohumangenes(codingIgH,Ig-lambda)microcellfusionbovinecelllinetransferredhamstercarriercelllinebovinecellscontainingthehumanchromosomefragmentcoweggsFusedintoresultingembryoscoweggsresultingembryostoproducefourcloned,transchromosomiccalvesrecipientcowsHumanantibodyproteinsweredetectedinthebloodofnewborncalvesIIMonoclonalantibodyandengineeringantibody表已批准上市的治疗性单抗2001淋巴瘤CD52人源化抗体Campath2000淋巴瘤CD33人源化抗体化疗药物交联物My