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芽孢杆菌定性定量检测方法近年来，微生态制剂在调控动物体内微生态平衡等方面的研究和应用正逐步深入，我国现在已经允许使用的安全微生物有很多种，枯草芽孢杆菌（BacillusSubtilis）因具有稳定性好、抗性强、复活率高等自身优势，成为研究和应用较多的菌种之一。它在目标动物肠道中，通过生物夺氧作用，拮抗致病微生物，并产生多种消化酶和多种营养物质，调节消化道健康，增强动物体的免疫功能，预防疾病的发生，达到促进目标动物的生长、提高饲料的转化率的目的。在微生态制剂检测中芽孢杆菌的数量以及芽孢率是衡量微生态制剂产品质量的重要指标。本文旨在介绍芽孢杆菌的特点及其快速、简便的定性、定量检测芽孢杆菌的方法。一、枯草芽孢杆的理化性质枯草芽孢杆菌菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色（见图1），在液体培养基中生长时，常形成皱褶。需氧菌。单个细胞0.7-0.8×2-3微米、著色均匀。无荚膜，全身鞭毛能活动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6-0.9×1.0-1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大（显微形态见图2）。图1枯草芽孢杆菌平板菌落图2枯草芽孢杆菌显微形态二、芽孢孢子的定性检测1、染色基本方法如下：（1）取微生态制剂样品1g，加入99mL无菌水，充分摇匀，37℃20-30min；（2）用接种环，取菌液，涂于载玻片，风干固定；（3）在涂菌液加入7.6%孔雀绿饱和水溶液，染色10分钟后，用水冲洗至无绿色即可，再用0.5%品红液染色1min，水冲洗、风干后镜检（100倍油镜加香柏油1滴）。2、结果判断：芽孢孢子呈绿色，营养体呈红色。三、芽孢孢子的定量检测1、血球计数板法（1）原理：利用血球计数板在光学显微镜下，查出芽孢个数，再用公式计算出1克样品中含芽孢个数。（2）仪器：血球计数板（25×16格），光学显微镜，刻度吸管，三角瓶，振荡器和玻璃球。（3）方法和步骤：a、取样及样品制备：称取待测样品1克（精确到0.1克）装入盛有99毫升水的三角瓶中，然后用振荡器或加玻璃球摇匀，使菌液均匀分布。用刻度吸管自三角瓶吸取菌液1毫升，装入盛有9毫升水的试管或装有99毫升水的三角瓶中，摇匀（扩大稀释倍数）待用。b、制片：用吸管从摇匀的菌液中吸取少许菌液，从盖玻片一端注入25×16的血球计数板，使菌液沿玻片间隙渗入，并用滤纸吸干槽中溢出的多余菌液。在操作过程中应注意不使计数板与玻片间产生气泡，否则重作，制好片后待查。c、检验计数：将制好的片放在光学显微镜下，放大到400倍，数四个角上的四个大格和中间的一个大格（共80个小格）的芽孢个数。公式：A=B×C×4×106⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯（1）A：1克待测样品中含芽孢总数（亿/克）；B：一个小格平均芽孢个数；C：稀释倍数；4×106：为血球计数板每小格1毫升容积的常数。2、平板菌落计数法（1）原理：平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌量。现在使用菌落单位（colony-formingunits，cfu）来表示样品中的活菌含量。（2）培养基的配置：用蛋白胨10g，牛肉膏5g，蒸馏水1000mL，制作pH为7.2-7.4的营养肉汤，在营养肉汤中加1.8％的琼脂，制成营养琼脂。（3）测定方法：以无菌操作称取试样25g，放入含有225mL灭菌稀释液的玻璃三角瓶中，置振荡器上，振荡30min，即为1:10的稀释液。将待测样品做10倍梯度稀释，可以做105、106、107、108等几个稀释度。取适当稀释度的稀释液各0.2mL至营养琼脂平皿上，用无菌L形棒或△形玻璃推子推匀。每个稀释度作3个重复，37℃培养18-24h，计数平皿上的菌落数，按下述公式计算样品含活菌数。原样品液含活菌数=同一稀释度的菌落平均数×稀释倍数×5四、讨论芽孢孢子染色是利用细菌的芽孢和菌体对染料亲和力的不同，且芽孢壁厚而致密，透性低，着色和脱色均较困难，所以用孔雀石绿和品红分步进行着色从而使菌体和芽孢呈现不同的颜色。在染用时用接种环取染色的菌液应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液。细菌的计数方法有很多，其中血球计数板法是一种用显微镜直接计数的方法，不需要进行菌体的培养，因此可以快速简便地检测细菌数量。在计数时，应注意当菌体位于小格的线上时，计数则数上线不数下线，数左线不数右线，即可减少误差。但是该方法不能将死细胞和活菌体区分开，因此不能客观反映出微生态制剂产品中的有效菌体数量，且存在计数不准确的缺点。涂布平板影响因素较少，重复性好，能准确的测定芽孢杆菌活菌数，现在广泛应有于生产的检测环节中。待测样品应在振荡器上充分振荡，使得芽孢杆菌可以充分、均匀地分散到待测溶液中，避免因为菌体未完全释放而引起结果中菌含量偏低的现象。接种培养时应该注意，应取适当稀释度的适当量稀释液至营养琼脂平皿上进行涂布。放置适当时间后，则立即将平皿翻转后放置培养箱中进行培养，以避免菌落蔓延生长，难以计数。菌落计数在完成培养后应立即进行，以防菌落继续生长蔓延从而影响了测定结果。在选择平板进行计数时，应选择菌落数在20～200个之间的平皿进行计数。一般来说，每平板含有20～200个菌落的稀释度的菌含量与实际结果最接近，超过200个/平皿或小于20个/平皿的计数结果则可能与实际存在较大差别。因此，应尽量选择20～200个/平皿的稀释度进行芽孢杆菌的计数，保证菌落计数的有效性。综上所述，检验人员应严格仔细地按照要求进行操作，避免人为因素造成结果偏差的情况。