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第六章沉淀反应（precipitationreaction)第一节沉淀反应的特点可溶性抗原+相应抗体肉眼可见的沉淀形成肉眼可见的大的免疫复合物。沉淀线或沉淀环的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形成的复合物第一阶段第二阶段沉淀反应分两个阶段抗原抗体特异性结合，快速但不可见。免疫比浊法中的速率法就是利用此阶段测定免疫复合物形成的速率。免疫浊度测定絮状沉淀试验单向扩散试验双向扩散试验对流免疫电泳火箭免疫电泳免疫电泳免疫固定电泳液体内沉淀试验凝胶内沉淀试验凝胶免疫电泳技术沉淀反应可分三类第二节液体内沉淀试验絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。根据沉淀现象的不同，液体内沉淀又可分为三类：絮状沉淀环状沉淀免疫浊度沉淀•方法受抗原抗体比例的影响非常明显•应用于测定抗原抗体反应的最适比例(三种类型)一、絮状沉淀试验(flocculation)抗原稀释法：抗原最适比例抗体稀释法：抗体最适比例方阵滴定法：抗原抗体最适比例絮状沉淀试验1.抗原稀释法(1)将可溶性抗原作一系列倍比稀释。(2)各管加入一定浓度的适量抗血清。(3)振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。(4)产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀释加入抗血清各管抗体量不变振摇混匀、37℃孵育沉淀量不同出现沉淀量最多的管为最适比例管。轻摇絮状沉示意图淀AgAbAg2.抗体稀释法本法采用抗原量恒定与不同倍比稀释度的抗体反应，出现沉淀物最多的管为抗体最适比例管。3.方阵滴定法抗原和抗体同时稀释，亦称棋盘(checkerboard)滴定法，是前二法的结合，可一次完成抗原和抗体的滴定并找出抗原、抗体的最适比。表6-1最适比方阵测定法抗体稀释度抗原稀释度1/101/201/401/801/1601/3201/640对照1/5++++++++++++±—1/10+++++++++++++—1/20+++++++++++++—1/40—±+++++++++—1/80————+++—4.方法评价絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，受抗原抗体比例影响非常明显，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。二、免疫浊度测定(immunoturbidimetry)原理：当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量2.抗体的质量：特异性强，效价高，亲和力强并使用R型抗体3.抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.54.使用增浊剂影响因素免疫浊度测定1.透射免疫比浊法2.散射免疫比浊法3.免疫胶乳比浊法分类免疫浊度测定第三节凝胶内沉淀试验（gelphaseprecipitation）可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。原理AbAg试管法单向琼脂扩散试验原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。技术要点：将抗体混入0.9%琼脂糖内（50℃），未凝固前倾注成平板，凝固后打孔（直径3～5mm），孔中加入抗原溶液和不同浓度的标准品，置湿盒内37℃,24～48h观察孔周围是否出现沉淀环。定量试验一、单向扩散试验（平板法）(singlediffusiontest)倾注平板打孔加样放置37℃24～48h观察沉淀环单向扩散试验（平板法）沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法Mancini曲线：大分子抗原时间扩散＞48h，常数K＝C∕d2普通坐标纸曲线C为抗原浓度，d为沉淀环直径单向扩散试验（平板法）T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线Mancini曲线t1为16～24h；t2为24～48h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线Fahey曲线Fahey曲线：小分子抗原扩散时间24h常数K＝logC∕d半对数坐标纸曲线C为抗原浓度，d为沉淀环直径标准品抗原浓度测定不同病人抗原浓度测定1.测定沉淀环直径2.在标准曲线上查找相应抗原浓度绘制标准曲线影响因素1.抗血清要求亲和力强、特异性好和效价高，注意保存。2.标准曲线必须每次制作。3.每次必须加质控血清。4.双环现象，不同扩散率抗原性相同的两个组分5.Ig测定中，可出现测量值降低：单克隆抗体。6.假阳性：多克隆抗体。二、双向扩散试验（doubleimmunodiffusiontest）原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。原理示意图AbAg模拟图染色标本图1.抗原抗体双向自由扩散2.24小时出结果3.呈现沉淀线或弧技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为3mm，孔间距在3～5mm之间，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒37℃18～24h后，观察孔周围是否出现沉淀环。1.检测未知抗原或抗体2.抗原性质分析3.抗体效价滴定4.抗原或抗体纯度鉴定AgAbABCDEFA:浓度Ag、Ab及分子量近似；B：浓度Ag、Ab近似，分子量Ag＜Ab；C：浓度Ag、Ab近似，分子量Ag＞Ab；D：浓度Ag＞Ab，分子量近似；E：浓度Ag＞Ab，分子量Ag＜Ab；F：浓度Ag＜Ab，分子量Ag＞Ab；2.抗原性质分析2表示标准Ag1表示待检Ag待检Ag与标准抗原完全吻合待检Ag中含有与标准Ag相同的Ag；还有另外的Ag与Ab相对应待检Ag有与Ab相对应的Ag，但与标准Ag不同待检Ag与标准Ag性质相同；但含量较低；1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。3.可进行任意稀释。“1”为单一抗原抗体系统。“n”为多个抗原抗体系统。*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。小结沉淀反应定义和特点沉淀反应的类型1.液体内沉淀试验絮状沉淀试验免疫浊度测定2.凝胶内沉淀试验单向扩散试验双向扩散试验3.免疫电泳技术重点掌握沉淀反应的含义和类型选择题1.影响絮状沉淀试验的主要因素是（）A.抗原的质量B.抗体的质量C.抗原抗体的比例D.反应溶液pHE.抗体特异性强2.双向扩散试验中沉淀环弯向抗原一方是因为（）A.抗原分子量大B.抗体分子量大C.抗原抗体分子量大致相等D.抗原含量大E.抗体含量大3.单向扩散试验出现双环的沉淀线是因为（）A.两种抗原B.两种抗体C.抗体为多克隆抗体D.抗原为多态性抗原E.抗原为性质相同的两个组分扩散率不同4.沉淀反应中的钩状效应是因为（）A.pH浓度过高B.pH浓度过低C.抗体过量D.抗原过量E.以上都不是5.单向扩散试验中大分子抗原和长时间扩散（48h）的结果处理宜用（）A.Mancini曲线B.Fahey曲线C.海德堡曲线D.直线E.抛物线第四节免疫电泳技术（immunoelectrophoresistechnique）电泳技术的基本原理•电泳：带电颗粒在电场的作用下向着其电性相反的电极移动，称为电泳。（electrophoresis）•电泳迁移率：同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内移动的距离。V:泳动速度cm/秒or分d:泳动距离cmt:电泳时间(秒/分)E:电场强度伏特/cm电泳技术的基本原理u:泳动率or泳动度(cm/伏·秒or分)U:电压常压(100—500v)高压(500—10000v)仅需几分钟l:支持场的长度(有效长度)•影响泳动率u的因素内因：1.净电荷2.质点大小3.质点形状外因：1.电场强度V(U/L)电场强度越大，带电质点泳动速度越快。2.缓冲液的pH(pH恒定)：溶液的pH值决定了带电质点的解离程度，也决定了物质所带电荷的多少。3.离子强度[I]溶液的离子强度越高，颗粒泳动速度越慢，反之越快。最适:0.02-0.074.电渗：液体对固体支持物的相对移动.由于琼脂中含有SO42-，带负电荷，造成静电感应致使附近的水带正电荷，而向负极移动•NH3+NH3+NH2|+OH-|+OH-|Pr-COOH======Pr-COO-======Pr-COO-+H++H+阳离子两性离子阴离子pHpIpH=pIpHpI•蛋白质的等电点(pI)：•在一定的介质中，某一蛋白质解离成阴、阳离子的趋势相等，成为两性离子(净电荷为零),此时介质的pH称为蛋白质的等电点。•电泳时有两种力，即电泳力和电渗力。•如果物质原来带正电荷，向负极移动，则因电渗作用向负极移动得更快。如果物质向正极移动，所带电荷少，电泳力抵不过电渗力，则也向负极移动。•支撑物•一般是采用琼脂或琼脂糖、纤维素膜、滤纸以及聚丙烯酰胺凝胶等。醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白架膜加盖接导线，开机醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白•电泳仪器优点：1.加快反应的速度。2.提高了灵敏度。3.增加了分辨率。电泳分析＋沉淀反应抗原抗体反应的高度特异性电泳技术的高分辨率、快速、微量免疫电泳技术免疫电泳包括:对流免疫电泳火箭电泳免疫电泳免疫固定电泳免疫印迹等原理：双向扩散+电泳比双向扩散试验灵敏度提高8－16倍技术要点：制备1.2%巴比妥琼脂凝胶板，在其上成对打孔，孔径3mm，孔距6mm，于阴极侧孔内加待测血清，阳性侧孔加抗血清，电泳条件3～4mA/cm，30min～1h。一、对流免疫电泳(counterimmunoeletrophoresis,CIEP)通电－蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动抗体球蛋白带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动＋对流免疫电泳结果分析：•无沉淀线出现则表明无相应的抗原。•沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。•沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度＞抗原，反之，则是抗体浓度＜抗原浓度。对流免疫电泳电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。原理单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术二、火箭免疫电泳(rocketimmunoeletrophoresis,RIE)1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧，6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。技术要点火箭免疫电泳1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。2.电泳终点时间的确定。3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形.4.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化），抵消了电渗作用。影响因素火箭免疫电泳火箭免疫电泳图①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本-+火箭免疫电泳示意图原理：区带电泳＋双向扩散1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散。技术要点：制备琼脂板打孔，加样于孔内，电泳2～3mA/cm，0.5～1h后，槽内加入相应抗血清作双向扩散。三、免疫电泳(immunoeletrophoresis,IEP)免疫电泳纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定影响因素抗原抗体比例不当,需测抗原抗体最适比抗血清的的抗体谱，混合抗血清的使用电泳条件直接影响分辨率应用-+免疫电泳示意图免疫电泳原理，不同之处是将抗血清直接加于电泳后的蛋白质区带表面，抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置形成抗原抗体复合物，经染色后，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型原理区带电泳＋沉淀反应四、免疫固定电泳Immunofixationelectrophoresis,IFE先将患者血清或血浆在醋纤膜或琼脂上作区带电泳，根据血清蛋白质的电荷不同将其分开，然后将IgG、IgA、IgM、κ轻链和λ轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道，