搜索
流式细胞术的样品制备FCM的样品制备包括单分散细胞悬液制备技术，细胞生物学特征标记技术及荧光染色技术，FCM是对细胞或细胞器的结构和某些功能进行定量测定，并可以根据细胞亚群的特点性质对其进行分类的技术。FCM的实验对象是单细胞或单细胞核的悬液，在FCM技术中制备出合格的单细胞悬液是非常重要的环节，这些单细胞悬液主要来源于单层细胞、血液、脱落细胞、实体组织及石蜡包埋组织等。一、单层培养细胞分散为单个细胞㈠贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备操作步骤：1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。2、加入少量0.25%胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有10%胎牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。3、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。（二）悬浮培养细胞单细胞悬液的制备操作步骤：1、离心去除旧培养液，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。2、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。二、实体组织单分散细胞的制备㈠新鲜实体组织新鲜实体组织是手术或活检后根据检测目的而采取的样品，此样品应及时进行适当的保存处理，如及时用固定剂或低温对组织进行保存，以避免由于室温过高、放置时间过长而造成组织自溶，影响检测结果。新鲜实体组织单细胞悬液制备方法如下：⒈酶消化法⒉机械法剪碎法网搓法研磨法⒊化学试剂处理法⒈酶消化法酶对实体组织分散作用原理主要有三方面：﹡一是可以破坏组织间的胶原。﹡二是可以水解组织细胞的紧密连结装置的蛋白性物质。﹡三是可以水解组织间的粘多糖物质。酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法，常用的酶类试剂有：•蛋白酶类，(如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，链蛋白酶和中性蛋白酶等)都能够释放所有组织中的细胞；•胰酶，能水解脂键和肽键；•胶原酶，能降解几种分子类型的胶原；•溶菌酶，能水解糖蛋白和肽的糖苷键；•弹性蛋白酶，能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维，可用于解离血管、心脏和肝脏的细胞。为使组织细胞分散下来，应用酶学方法必须注意条件的选择和影响因素：※酶需要溶解于适当的溶液中，而这种溶液不致于造成酶效价降低※注意组织在消化液中的消化时间※注意酶活性的PH值※注意酶的适用浓度※随时注意影响酶活性的其他因素各种酶的分散程度都有一定的限制性，特别是在进行免疫标记实验时，酶处理可能改变细胞膜的成分，从而影响细胞亚群的区分。应指出，用于组织分散的很多酶是不够纯的，不仅含有一种占主导的酶，而且在不同程度上也混有其他污染物质，它们的活性可能有利于组织分散，也可能对组织的结构或功能产生不利的影响。酶学方法的一般程序：①将适合于酶消化的组织置于离心管中。②将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中。③一般消化20-30分钟(恒温37ºC或室温)，消化期间要间接振荡或吹打。④终止消化，收集细胞悬液，以尼龙网(200目)过滤，除去大团块，以低速离心除去细胞碎片。⑤将制备好的单细胞进行流式细胞术分析或保存。⒉机械法机械法分裂实体组织包括：用剪刀剪碎或用锋利的解剖刀剁碎，用匀浆器匀浆，用细注射针头抽吸细胞以分散细胞，采用网搓法同样也能获得大量的细胞，机械法易造成细胞悬液中细胞碎片，所以机械法常与其他方法配合使用。常用的几种机械法制备过程如下：剪碎法：①将组织块放入平皿中，加入少量的盐水。②用剪刀将组织剪至匀浆状。③加入10ml生理盐水。④用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中。⑤离心沉淀1000prm3-5分钟，再用生理盐水洗三次，每次以短时低速离心沉淀(500-800prm)去除细胞碎片。⑥以300目尼龙网过滤除去细胞团块。⑦70%冰乙醇固定，放入4℃冰箱。网搓法：①将100目铜网扎在小烧杯上。②把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直到将组织搓完。③用300目的尼龙网过滤细胞悬液除去大的团块④收集细胞悬液，离心沉淀1000prm，5分钟。⑤70%乙醇固定，置4℃冰箱备用。研磨法准备一只70ml组织研磨器①将组织剪碎至小块。②放入组织研磨器中，加入1-2ml生理盐水。③转动研棒，研至匀浆即可。④加入生理盐水10-20ml，冲洗研器。⑤收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800prm，1-2分钟，再用生理盐水洗三次，离心沉淀。⒊化学试剂处理法化学试剂处理法的主要原理是将细胞间起粘连作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散下来。试剂配制：①0.2%EDTA配制EDTA0.2g溶解后，加入Hank´s液100ml，封装高压消毒，置0-4℃保存。②胰酶加EDTA配制胰酶0.25g+PBS(PH7.0)200ml，浓度0.125%，EDTA0.2g+PBS(PH7.0)200ml，浓度0.2%。各取40ml混合，分装置冰箱保存，用时过滤既可。实验步骤：①将组织切成薄片放入试管。②加入EDTA液5ml，室温，半小时，弃之。③加入胰酶+EDTA液5-10ml，在37℃恒温水浴30分钟，间断振荡3-5次。④用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000prm，5分钟，再以生理盐水洗2-3次，离心500-800prm，1-2分钟。⑤70%乙醇固定置冰箱中被检。实验证实，用化学试剂处理组织导致细胞成活率降低，细胞产额较低，细胞碎片和细胞丛结的量不稳定，因此，化学试剂处理方法不单独使用，可与其他方法联合使用。机械法常常造成严重的细胞损伤，较低的细胞产量，为使细胞碎片不影响FCM检测结果，需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片。酶学法对实体肿瘤的分散解聚是较理想的，但是会对所测化学成分造成不良影响，所以根据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样品和更好的FCM结果。注意事项：Ⅰ新鲜组织标本应及时进行保存，以免组织在室温下放置时间过长，造成细胞自溶导致DNA降解，影响FCM测定结果。Ⅱ根据实验目的选用最佳的细胞固定方法，以免由于固定剂的原因，造成FCM检测结果的不稳定。Ⅲ酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响。Ⅳ需注意不同的组织选用适当的方法，如富于细胞的肿瘤(淋巴瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化癌、髓样癌以及一些软组织肉瘤)不一定要用酶学或化学法，往往用单独的机械法就可以收到大量单分散细胞。Ⅴ在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤，如食管癌、乳癌、皮肤癌等，用胶原酶为好，因为胶原酶具有在Ca2＋、Mg2＋存在或在血清状态下不发生活性降低的特征。实验方法：①石蜡包埋组织在切片机上切取40-50μm厚的组织片3-5片。②将切取的组织片放入试管中。③加入二甲苯5-8ml脱蜡(在室温下)，1-2天，视石蜡脱净与否，可更换一次二甲苯，蜡脱净后弃去二甲苯。④水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度的酒精5ml，每步10分钟，去乙醇，加入蒸馏水3-5ml，10分钟后弃之。⑤消化：加入2ml0.5%胃蛋白酶(pH值1.5-2.0)置37℃恒温水浴中消化30分钟，消化期间每隔10分钟振荡一次。石蜡包埋组织单细胞悬液的制备⑥消化30分钟后，立即加入生理盐水终止消化。⑦经300目尼龙网过滤，未消化完的组织片可以二次消化。⑧收集细胞悬液，离心沉淀1500prm，以生理盐水漂洗1-2次，离心沉淀1500prm，再以生理盐水漂洗1-2次，离心沉淀500-800prm，去碎片。⑨制备好的单细胞悬液作涂片，AO染色在荧光显微镜下观察，应为完整细胞核，核发出黄绿色荧光。⑩单细胞样品1×106细胞/ml，加入荧光染液溴化乙啶(EB)或碘化丙啶(PI)1ml，置0-4℃冰箱30分钟，经300目尼龙网过滤后上机检测。注意事项：一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡脱净的方法是，弃去二甲苯，加入100%乙醇，如无絮状物浮起，即视为石蜡已脱净，反之则没有脱净。消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化掉。切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间过长，一般以40-50μm为宜。二、血液单细胞样品的制备血液是天然的单细胞分散细胞悬液，血中的细胞成分在生理状态下呈分散的游离状态，它是流式细胞分析的最合适的样品，全血中含有红细胞，白细胞和血小板三种有形成分，但流式细胞的检测是以某一群细胞为测定对象，因此在检测前须将所测的某群细胞分离出来，下面分别介绍几种血细胞的分离制备方法。㈠淋巴细胞的制备⒈取肝素抗凝血2.0ml，用生理盐水2ml将全血稀释至4ml。⒉先将3ml人淋巴细胞分离液放入另一个离心管，然后将稀释后的血沿试管内壁缓缓加入到分离液面之上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态。⒊离心2000prm，30分钟，室温18-20℃，离心后可见试管内的血液清楚的分为4层，上层为血浆层，中层为分离液层(淋巴细胞所处的位置在血浆层与分离液层中间)，底层为红细胞，红细胞上为粒细胞。⒋用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞吸出，收集到另一支离心管，用生理盐水稀释至10ml，离心洗涤2次，每次均以1500prm,10分钟，弃上清后即得到纯度较高的淋巴细胞，但可有少量的单核细胞。⒌70%冰乙醇固定，置4℃冰箱保存。㈡粒细胞的制备⒈用淋巴细胞分离液对细胞进行分层。⒉粒细胞的比重较淋巴细胞稍大，因此经分离液分离后的粒细胞，分层于红细胞之上，分离液的底部。⒊以吸管慢慢将粒细胞层吸出，置另一支离心管内，以5ml的Hank′s液洗涤三次，每次离心沉淀1500prm，10分钟。⒋在吸取粒细胞的同时常附带一些红细胞，因此需将红细胞去除，加入1.0ml低渗溶液，30-40秒。⒌再以Hank′s液洗涤2次，即可获得纯度大于95%以上的粒细胞。㈢单核细胞制备1.取肝素1000u/ml抗凝全血3.0m1,加入3.0ml生理盐水将血稀释,均在无菌条件下操作。2.1640培养液10.0ml,放入培养瓶内,将稀释血加入培养液中,混匀,与培养瓶接触面要大。3.放入37℃恒温箱内孵育30-40分钟,取出培养瓶,将血倾倒掉,用生理盐水将培养瓶轻轻冲洗一次,以去掉残留的血液,这时培养瓶壁上贴附了大量的单核细胞,因为单核细胞具有短时培养期内贴附快的特点,而其他细胞没有这个特性,所以利用这一特性进行短时培养可获得较纯的单核细胞。4.将粘附于培养瓶壁上的单核细胞消化下来,用0.25%胰酶消化10－15分钟,室温下,并不断摇震,以促使细胞脱落下,单核细胞的粘附力很强,用酶消化往往获得细胞数少,目前亦采用机械的方法,用一橡皮刷,伸入培养瓶在瓶壁上轻擦,将细胞刮取下,但切勿用力过大,造成细胞损伤过多。5.脱落下来的细胞移入离心管,离心沉淀1500prm,5分钟,再以生理盐水漂洗2－3次,每次离心800prm,2分钟,以去除碎片杂质。6.将细胞涂片,以丫啶橙染色,置荧光显微镜下观察形态和纯度。7.将细胞以70%乙醇固定,置0-4℃冰箱保存备检。三、脱落细胞单细胞悬液的制备在临床实际工作中，可收集到大量自然脱落的细胞，这些细胞标本经过简单的处理，就可得到较好的单分散细胞悬液，所以是流式细胞术检测的天然样品，下面介绍几种常见的脱落细胞样品制备方法。㈠宫颈脱落细胞悬液的制备1.首先用生理盐水冲洗宫颈表面的分泌物,以海棉轻拭宫颈表面,将海棉中吸附的脱落细胞洗脱到20ml生理盐水中。2.收集细胞悬液,以1500prm离心沉淀,用生理盐水洗涤2次,每次5分钟,弃上清后加入70%乙醇3ml固定备检。㈡食管脱落细胞悬液的制备1.将食管拉网器上的细胞洗脱到10ml生理盐水中,以1500prm离心沉淀,再用生理盐水洗涤2次,离心500-800prm1-2分钟,弃上清。2.调整细胞数在1X106/ml,可进行标记染色上机,如不马上检测可用70%的冰乙醇固定保存。3.在标记染色前如发现细胞有团块聚集，可