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DNA复制、修复1.原核生物复制相关酶和蛋白及其功能一、DNA聚合酶种类：①DNA聚合酶I：由一条单一肽链组成，是一个多功能酶，包括：DNA聚合酶活性3′-5′外切核酸酶活性，被认为起着校对的功能，能切除聚合过程中的错配碱基5′-3′外切核酸酶活性②DNA聚合酶II：没有5′-3′核酸外切酶活性，次要的DNA修复酶③DNA聚合酶III：是真正的DNA复制酶（多亚基、多层次组装）④DNA聚合酶IV⑤DNA聚合酶V（以上两种酶参与SOS修复）二、解螺旋酶解螺旋酶利用水解NTP产生的能量在复制叉处打断氢键，使亲代DNA双链分离。三、旋转酶通过水解ATP引入负超螺旋，消除复制叉前进带来的扭曲张力四、SSB蛋白（单链结合蛋白）SSB蛋白与单链结合：防止单链复性维持单链刚性状态避免单链降解SSB蛋白的结合具有协同效应五、引发酶引发酶是一种RNA聚合酶，能够合成RNA短片段作为DNA合成的引物。六、DNA连接酶1、酶活化2、AMP转移3、3′-OH亲核攻击2.碱基替代①转换：两种嘧啶之间或两种嘌呤之间互换，这种置换方式最为常见。②颠换：在嘌呤与嘧啶之间发生互换，较为少见。3.增变基因增变基因的突变引起整个基因组突变率的明显上升。如编码DNA聚合酶的各个基因，和修复相关酶的基因。4.SOS反应①是细胞DNA受损或复制系统被抑制时产生的应急反应，②SOS反应包括：溶原性细菌释放噬菌体；DNA损伤的修复效应和诱变效应；细胞分裂的抑制。③诱导的修复系统：避免差错的修复系统倾向差错的修复系统④SOS诱导产生DNA聚合酶Ⅳ和V：PolIV和PolV没有3’核酸外切酶校正功能，使DNA链在损伤部位出现不配对碱基时，复制仍能继续前进。在此情况下允许错配可增加存活的机会。⑤SOS反应由RecA蛋白和LexA蛋白相互作用引起。RecA被称为辅蛋白酶，在有单链DNA和ATP存在时，RecA蛋白被激活而促进LexA自身的蛋白水解酶活性。LexA蛋白是许多基因的阻遏物，当它被RecA激活自身的蛋白水解酶活性后自我分解，使一系列SOS基因得以表达，如:umuDC(编码DNA聚合酶V)，dinB(编码DNA聚合酶Ⅳ)RNA转录1.原核生物启动子的种类①-10序列：T80A95T45A60A50T96又称为牢固结合位点，在这一区域DNA双链熔解，形成开放复合物②-35序列：T82T84G78A65C54A45为RNA聚合酶识别位点，又称为初始结合位点③CAP位点：位点I-70~-50位点II-50~-402.原核生物的转录过程①起始：全酶结合DNA，封闭的二元复合物，DNA溶解，开放的二元复合物，流产起始，三元复合物，σ因子释放或改变构象，RNA合成起始。②延伸：（1）核苷酸的进入：Bridge蛋白（直构型）与核苷酸进入位点相邻新的核苷酸结合到核苷酸进入位点Bridge蛋白转变为弯曲构型，移动一个碱基的距离Bridge恢复为直构型，等待下一个核苷酸的进入（2）延伸中的拓扑异构：转录过程中，在RNA聚合酶前方和后方分别产生正超螺旋和负超螺旋，因此，在转录延伸过程中需要旋转酶(引入负超螺旋)和拓扑异构酶I(消除负超螺旋)（3）尺蠖模型③终止：（1）不依赖ρ因子的终止子结构特征：发夹结构；末端有一系列U核苷酸(约6个)；茎基部通常包含一个富含G-C的区域。作用机制：发夹形成，RNA聚合酶暂停，DNA模板和转录产物之间仅以A-U键连接。键断裂，释放RNA链，转录终止。（2）依赖ρ因子的终止子：结构特征：同样包含发夹结构；无其他固定特征。ρ因子的结构：ρ因子具有N端的RNA结合域和C端的ATPase酶活性，ρ因子六聚体形成一个有缺口的环状结构。从RNA的3’端，沿着六聚体N端结合域的外侧，缠绕RNA，同时将所结合RNA区域的5’端引入内部，与C端的另一个RNA结合域结合。RNA5‘端的持续引入，最终表现为ρ因子六聚体沿RNA5’－3‘方向移动ρ因子终止转录：RNA合成起始以后，ρ因子附着在新生的RNA链上，依靠水解ATP产生的能量，沿着5’→3’方向朝RNA聚合酶移动终止子形成发夹结构，ρ因子追上暂停的RNA聚合酶ρ因子解开DNA/RNA杂合链，使RNA链从DNA模板上释放，转录过程终止3.核内小RNA的种类SnRNA(核内小RNA）与特异性蛋白结合，形成核内小核糖核蛋白颗粒(SnRNPs)。mRNA前体和SnRNPs动态聚合，形成剪接体。SnRNPs：U1、U2、U4、U5、U6SnRNA与mRNA、或snRNAs之间具有互补序列，这种碱基互补配对在剪切过程中具有重要作用4.依赖ρ因子的终止子和不依赖ρ因子的终止子结构的区别和作用机理①不依赖ρ因子的终止子结构特征：发夹结构；末端有一系列U核苷酸(约6个)；茎基部通常包含一个富含G-C的区域。作用机制：（1）发夹形成，RNA聚合酶暂停，DNA模板和转录产物之间仅以A-U键连接。（2）键断裂，释放RNA链，转录终止。②依赖ρ因子的终止子：结构特征：同样包含发夹结构；无其他固定特征。ρ因子的结构：ρ因子具有N端的RNA结合域和C端的ATPase酶活性，ρ因子六聚体形成一个有缺口的环状结构。从RNA的3’端，沿着六聚体N端结合域的外侧，缠绕RNA，同时将所结合RNA区域的5’端引入内部，与C端的另一个RNA结合域结合。RNA5‘端的持续引入，最终表现为ρ因子六聚体沿RNA5’－3‘方向移动ρ因子终止转录：（1）RNA合成起始以后，ρ因子附着在新生的RNA链上，依靠水解ATP产生的能量，沿着5’→3’方向朝RNA聚合酶移动（2）终止子形成发夹结构，ρ因子追上暂停的RNA聚合酶（3）ρ因子解开DNA/RNA杂合链，使RNA链从DNA模板上释放，转录过程终止5.逆转录过程①负DNA链合成（第一次跳跃）tRNA引物和病毒RNA链结合；逆转录酶合成负链DNA，到达模板末端后产生负链强终止DNA；RNA链的5’末端区域被降解；单链DNA末端的R区，在第一次跳跃中与另一条病毒RNA链互补配对；继续逆转录，产生U3-R-U5的长末端重复序列；②正DNA链合成（第二次跳跃）：RNA链被降解，只留下作为DNA合成引物的片段；合成正链强终止DNA；tRNA引物被除去；正链强终止DNA进行第二次跳跃，转移到负链DNA的另一端；完成正链和负链的合成。③病毒DNA的整合在一个核糖核蛋白复合物中，整合酶将线性DNA分子的两末端汇集到一起；并使LTR的3’端失去2个bp整合酶交错4bp切开靶位点整合酶连接病毒DNA的3’端和靶位点的5’端，单链区由寄主细胞的酶系统修复翻译1.原核生物翻译的起始和延伸过程起始过程：第一步，30S小亚基首先与翻译起始因子IF-1，IF-3结合，通过SD序列与mRNA模板结合。第二步，在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。第三步，带有tRNA，mRNA，三个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。延伸过程:新进入的氨酰tRNA结合到70S核糖体的A位点上。肽键的形成:这一过程需要肽酰转移酶。同时，P位点上tRNA卸载肽链移位:核糖体沿mRNA移动一个密码子的距离2.分子伴侣的种类和主要特征胁迫70家族：以单体蛋白的方式和底物结合，控制其折叠。包括Hsp70,Hsp40和GrpE，通过水解ATP提供的能量来改变底物蛋白的结构分子伴侣家族：组成一个形成特定形状（如圆筒状）的大分子寡聚物，使未折叠蛋白进入寡聚物内部，并引导其进行正确折叠GroEL/GroES在所有生物体中都存在;TRiC仅存在于真核生物细胞质中3.蛋白质运输分泌的两种途径翻译中运输:由与内质网结合的核糖体完成。新生肽链在合成过程中，插入到内质网上的特殊通道，然后转移入内腔翻译后运输:由游离核糖体完成。在多肽链合成后，将蛋白质从细胞质转移到线粒体或叶绿体等细胞器和细胞核中。翻译中运输的过程：①新生肽链从核糖体出现并延伸②信号肽被信号识别体SRP所识别③翻译暂时中止④SRP-核糖体复合物与内质网上SRP受体(停泊蛋白)结合⑤新生肽链进入易位子⑥SRP释放，多肽链移位到内质网内腔，信号肽被信号肽酶切除原核生物基因表达调控1.乳糖操纵子（组成，与调控有关的基因）乳糖操纵子是由一组功能相关的结构基因，操纵基因和与RNA聚合酶结合的启动基因组成。调节基因编码的产物阻遏蛋白可调节操纵基因的开与关。当无诱导物乳糖存在时，调节基因编码的阻遏蛋白处于活性状态，阻遏蛋白可以操纵基因结合，阻止了RNA聚合酶与启动基因的结合，结构基因不能编码参与乳糖分解代谢的3种酶：-半乳糖苷酶，-半乳糖苷透性酶和-乳糖苷转乙酰基酶。在诱导物乳糖存在的情况下，乳糖同阻遏蛋白结合，阻遏蛋白发生构象变化而处于失活状态，此时结构基因可转录一条多顺反子的mRNA，并翻译乳糖分解代谢的3种酶。2.色氨酸操纵子（结构，前导序列）①大肠杆菌色氨酸操纵子的负调控：色氨酸操纵子控制5种酶的合成，由trpE,D,C,B,A编码当色氨酸缺乏时，调节基因（trpR）编码无活性的aporepressor阻遏蛋白当细胞中色氨酸浓度较高时，色氨酸和aporepressor结合，形成有活性的色氨酸操纵子阻遏蛋白②大肠杆菌色氨酸操纵子的衰减作用：色氨酸衰减子的结构：TrpmRNA的5’端有139个核苷酸组成的前导序列，前导序列有4个区域彼此互补：1－2，2－3，3－4，3－4发夹结构随后为8个连续UTrpmRNA的5’编码14个氨基酸组成的前导肽，前导肽特点是含有两个连续Trp细菌中，转录和翻译耦联，RNA聚合酶刚转录出部分前导序列，核糖体就开始翻译调控过程:Trp饥饿:核糖体停顿在两个Trp密码子上，核糖体占据1区，2区和3区配对，形成发夹结构，4区转录出来后仍是单链状态，终止子不能形成，转录继续进行有充分的色氨酸:核糖体顺利完成前导序列的合成，到达并占据1区和2区，使2区不能与3区有效配对，从而3区和4区配对产生终止子的发夹结构，转录终止分子生物学技术1.PCR原理①反应体系：含有目的基因或序列的DNA模板热稳定的NDA聚合酶（Taq酶）一对脱氧寡核苷酸引物4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）Buffer及Mg2+等②反应过程：变性：升高温度使模板DNA变性、双链分开；退火：再降低温度使引物与模板DNA配对互补结合；延伸：然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3’羟基端开始，与模板DNA上的碱基配对逐个加上核苷酸，合成新的DNA链。循环：其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循环，新合成的DNA在下一循环中又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍。2.基因敲除通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到敲除特定靶基因的目的。①基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。②ES细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞③同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(EScell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。④选择筛选已击中的细胞：基因转移的同源重组自然发生率极低，目前常用的方法如正负筛选法以及PCR法。⑤表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。⑥得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传3.RNA干扰利用了由小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRN