铜绿微囊藻

淡水铜绿微囊藻中无机砷的释放，转化，富集的研究引言：砷不仅是一种潜在的有毒类金属而且是一种环境污染物，人类经常接触到含有这种污染物食物，水，空气和土壤。世界上，超过1.5亿都接触到含有超过国际卫生组织推荐标准10ug/L的砷。天然水中砷浓度的变化是很大的，变化范围0.5ug/L~5000ug/L。一些污染的淡水中砷的浓度高达20mg/L。水体砷污染是一个普遍的、急切的问题，它需要我们采取立刻行动来改善水质。生物体中砷的毒性和生物富集不仅取决于砷的总量而且也取决于砷的形态。虽然自然环境中砷存在几种氧化形态，但是淡水中三价砷和五价砷的含氧离子比有机砷更常见。人们普遍认为，除了三价甲基化代谢产物（如：单甲基胂酸和二甲基胂酸）和含巯基的五价甲基化代谢产物（如：巯基二甲基砷酸），在哺乳动物体内，无机砷比有机砷毒性更大。水生系统内，主要的无机砷进入到微生物中,例如:浮游植物，并且进而被转化成甲基胂或者像As这样更高价态的有机砷。由于藻类具有很高的从水环境中富集砷的能力，因此他们对水环境中砷旳生物富集和生物转化具有重要作用，并且决定着高等生物可利用砷的形态以及他们随后的转化。最近的研究表明:不同的藻类对无机砷的吸收能力具有很大的不同。在水生系统中，蓝藻细菌是最大、最重要的能够进行氧化光合作用的原核自养生物菌群之一。，正如富营养化淡水中最常见的有毒蓝藻一样，铜绿微囊藻能够形成引起其他动物中毒的水花并且对人类的健康具有一定的风险。由于藻类的不同生长阶段砷的主要形态不同，故砷的吸收随着藻类生长阶段不同而异。至今，关于浮游植物对砷的吸收、富集和生物转化，由于五价砷的降解以及其代谢与磷的关系的详尽研究，多数研究已经关注海洋生物，尤其是真核藻类。鲜为人知的是，淡水中有毒藻类的水花不同无机砷形态的生物转化之间的比较，特别是在由蓝藻引起的水花期间，形态转化和释放过程的比较。如果这种水被饮用，它将对人类和其他生物存在潜在的环境风险，因此，我们有必要了解它们的相关性。因此，我们研究的主要目的是调查砷在铜绿微囊藻中的生物转化和生物富集以及它们向不同浓度砷污染水体的释放。用生长研究来确定无机砷对铜绿微囊藻的毒性效应。对于了解砷的生物转化机制以及预测因砷污染引起的蓝藻爆发的风险，藻类和环境中砷的形态的变化是重要的指标。结果：藻类的生长和无机砷的毒性无机砷对藻类（铜绿微囊藻）的毒性效应是明确的。藻类生长的抑制率随砷浓度的增加而增加。这种藻类对砷表现出极强的耐受性，对三价砷的72-hIC50值为3.582uM，五价砷72-hIC50值为133uM，这表明对于铜绿微囊藻三价砷的毒性比五价砷的毒性更强。72-hIC50比预期的环境中砷的浓度具有更高的数量级。图表一反映了在不同浓度下，铜绿微囊藻的叶绿素a浓度和藻类细胞密度随时间的变化。在15天的培养期内，空白组与不同浓度砷处理组叶绿素a浓度和藻类细胞密度有很大的差异。叶绿素a浓度和藻类细胞密度都随对数生长期孵化时间的延长而渐渐地增加，这表明：在此浓度范围内，五价砷这种藻类没有明显的生长刺激作用或者致毒效应。在空白对照组和5~20uM不同浓度的三价砷处理下，叶绿素a浓度和藻类细胞密度没有明显的变化。然而，50uM的三价砷处理组在起始阶段就抑制了藻类的生长。虽然与空白组和其他处理组相比，细胞数量和叶绿素a的总量明显的减少，但是它在第七天开始微弱的重新生成并且随后成倍数增长。在100uM三价砷处理7天之后藻类基本全部死亡，这表明：藻类对三价砷是极其的敏感。铜绿微囊藻对砷的富集藻类细胞内砷的浓度在15天的三价砷处理下比其在五价砷处理下要高很多。对照组，藻类中砷的浓度只有4ug/g,这表明最初的藻类并没有被砷污染。在15天的孵化期内，铜绿微囊藻富集的总砷量是与添加在环境中砷的浓度的增加成比例的。细胞内砷的量在五价砷处理下最大值为96ug/g，而在三价砷处理下其最大值为260ug/g，明显要高很多。在15天之后，细胞内的砷占添加在环境中总砷的百分数，100uM五价砷处理的能够达到12%而50uM三价砷处理的为21%。由于在100uM三价砷处理下，藻类在5天之后就死亡了，故没有此条件下细胞内砷的数据。砷吸收的动力学常数用拟合双曲线模型来表示，而砷富集的数据用非线性回归模型来表示。砷吸收能够用米氏方程来很好的描述，三价砷的R²值为0.940，五价砷的R²值为0.973。米氏计算表明：三价砷的最大吸收率是五价砷的两倍还多。三价砷的半饱和浓度为27.66±6.484而五价砷的为25.15±6.241。砷的四种形态五价砷、三价砷、甲基胂和二甲基胂在不同的三价砷处理下在藻类细胞内都能够检测到。然而，五价砷处理的没有发现甲基胂，而三价砷处的有0.10~0.15ug/g的甲基胂。砷的形态分析表明：三价砷或者是五价砷处理下五价砷是主要的形态占总砷的78-93%，而另一种形态的无机砷三价砷是次要的形态，占总砷的6-21%。另外，在不同的处理下少量的有机砷占总砷的量不到1%。这种藻类从三价砷溶液中富集五价砷的量比从五价砷溶液中富集的相对较多。细胞对砷的富集与添加在环境中三价砷和五价砷的量呈比例的。细胞中而甲基胂的量在三价砷和五价砷处理下是相同的，并且是一个稳定的值10uM。与五价砷的富集相反，五价砷处理下的三价砷的富集变化很大8.9~20.3ug/g，与空白对照组也明显不同。然而，在三价砷处理下，三价砷富集的趋势与细胞内五价砷浓度很相似，它随三价砷的增加而明显增加。生长环境中砷形态的变化尽管在含有三价砷（约15％）的生长培养基中发现了少量的ASV，在后15天的潜伏期空白对照组的藻类中没有发现任何砷形态的转化。这证实，在整个测试期间，它们在生长培养基中的相对稳定性。只有微量三价砷分别存在于含有铜绿微囊藻试验介质，并在五价砷处理组前5天随时间增加而减少。三价砷从最初的五价砷还原而来，并且随着最初的五价砷浓度的增加而增加。然而，在空白组没有发现三价砷，这表明:含有铜绿微囊藻的培养基中的三价砷来自于生物还原作用。在其他日子里，培养基中三价砷的还原也微弱的发生着。至于五价砷的处理组，五价砷的浓度随着时间的增加而减少。虽然最低值是在第13天出现的，五价砷在15天的内保持相对稳定并在培养基中占主导地位。在这些培养基中甲基砷包括单甲基胂和二甲基胂也能检测到更低的浓度。另外，它们都随时间的增加而增加，并且在不同的浓度下没有显著的差异。在含有三价砷的培养基中，砷的形态发生着明显的变化。随着藻类的指数增长，三价砷的浓度随着时间而迅速减少，并且由于生物和化学氧化作用使三价砷被氧化成五价砷，所以三价砷在第七天几乎就检测不到了。然而，培养基的最初阶段五价砷迅速出现，然后在第七天成为主要的形态。实验最后，溶液中99%的砷以五价砷的形式存在。砷的另外两种形式，甲基胂和而甲基胂，在第五天可以同时检测到，在含有三价砷不同浓度的培养基的15天潜伏期内，它们都随时间的增加而增加。另外，培养基中而甲基胂的浓度比甲基胂的高。实验中，我们发现两种还原产物的总量与最后培养基中砷的总量有很大的差异，这表明：还存在其他砷的不明形态向溶液中释放。很明显，有很少的挥发性砷的损失，我们可以用古老的砷斑法测得。从图6a中可以看出，三价砷的释放率从4.7×10-³to4.3×10-¹μM/g/天，随着五价砷的浓度的增加而急剧增加。这表明，三价砷的主要是由生产五价砷处理过的铜绿微囊藻产生和释放的。单甲基砷的平均释放率在10uM的五价砷下达到峰值2.6×10−2μM/g/天，而而甲基胂的平均释放率在10uM的五价砷下达到峰值7.7×10−2μM/g/天。显然，我们在五价砷处理的溶液中前五天仅发现了三价砷，其平均释放率比有机砷要高，尤其是在第二天。从图6b中可以看出，在15天的潜伏期内，五价砷，甲基胂和二甲基胂的平均释放率都随三价砷浓度的增加而增加，特别是三价砷的浓度为50uM时。这表明砷的甲基化与生物氧化是同时发生的。讨论铜绿微囊藻对砷的富集在此研究中，测试培养基中铜绿微囊藻对砷的富集随着三价砷和五价砷的浓度的增加而增加。主动吸收在藻类对砷的富集有主要的作用。确实，相似的研究已经记录了聚球藻和小球藻的富集作用。三价砷的最大值是五价砷的两倍多，这表明：作为磷的类似物，在过量的磷存在的条件下，铜绿微囊藻对砷的吸收很难进行。由于三价砷在pH为6.0时不溶的中性分子存在，所以它能够通过一些植物的水通道蛋白进行转化。因此，这项研究发现在高浓度的磷溶液中，三价砷的吸收率比五价砷的高。随后，与五价砷处理的相比，三价砷处理组细胞内砷的浓度明显提高了。另外，铜绿微囊藻比其他淡水藻类对砷具有更强的生物富集能力。结果显示：铜绿微囊藻细胞内超过7%的砷是在第十五天从培养基中吸收的。的确，以前的报告表明：聚球藻和小球藻能够从被砷污染的环境中富集更多的砷。结论是:由于水花中砷的生物富集对人类和动物具有潜在的危害，所以我们应该给予更多的关注。铜绿微囊藻中砷的形态细胞内砷形态的分布清楚的证明：用5~100uM的三价砷或者五价砷处理15天之后，五价砷是主要的形态，接着依次是三价砷，二甲基胂和甲基胂。此研究也表明：在富含三价砷和磷的淡水中，藻类细胞内的主要转化形式是三价砷到五价砷的生物氧化。：聚球藻和小球藻也存在相似的转化。Meada有相似的发现：淡水中的聚球藻95%的砷是以无机态的形式而富集，甲基胂化合物则主要是二甲基胂。在我们的研究中，用不同浓度的三价砷或者五价砷处理15天之后，细胞内砷的形态发生了明显的变化。随着添加的砷浓度的增加，细胞内砷的主要形态五价砷也迅速增加。正如Maeda在聚球藻的调查中推断的，甲基胂的含量是藻类富集的限制因素。细胞内的砷在三价砷处理后有一个相似的趋势，而五价砷处理后急剧波动。然而，与三价砷处理的相比，五价砷处理组的细胞内三价砷的富集量占的比例更大。这些结果表明：铜绿微囊藻把五价砷生物转化为还原态的能力并作为甲基化的反应物。培养基中砷形态的变化含有无机砷的培养基中砷形态的迅速变化表明：铜绿微囊藻能够氧化、还原、甲基化并且向培养基中释放砷。虽然一部分砷能够进入到细胞里，但是大部分的砷明显的被代谢并被释放到周围的水中。正如Sanders和Cullen记录的那样，最初阶段，五价砷到三价砷的还原是非常迅速的，它与接触到的五价砷的浓度呈正相关。培养液中三价砷的一个峰值出现在最初阶段，比Hellweger记录的水花出现的要早。人们普遍认为，培养基中有机砷的量取决于甲基化/二甲基化率以及释放过程。培养液中发现了甲基胂而细胞中几乎没有，这表明:无机砷的甲基化过程也是含五价砷的培养基中甲基胂和二甲基胂的释放过程一样迅速。在含有以三价砷为主的培养基内，藻类对三价砷的氧化率是显著地，尤其是在50uM的三价砷下。三价砷的平均释放率随三价砷的浓度的增加而增加，这表明：藻类对五价砷的还原产物随培养基中砷浓度的增加而增加。铜绿微囊藻的还原率2.0×10-2〜4.3×10-1uM/g/天与以前从绿藻小球藻预计净减少率相似。一般说来，生物氧化是三价砷生物转化的最初的转化机制，然而，生物还原以及以后的甲基化对五价砷的生物转化起着重要的作用。另外，这也说明，藻类对三价砷更敏感。类似的结果也经常被报道。类似的研究表明:砷污染的水体里爆发的水花比淡水中的对砷具有更强的耐受能力，并且在砷污染的水体中还有可能成为优势。因此，砷的毒性不仅取决于培养基中砷的形态，也取决于生物转化的特殊机制和藻类生物转化的喜好。结论这项研究的目的是铜绿微囊藻对无机砷的生物富集和生物转化，以及有蓝藻爆发的优势物种引起的培养基中砷形态的变化。来自于砷污染的湖泊的铜绿微囊藻对五价砷具有很高的耐受能力，并且对自己的生长几乎没有影响。尽管在五价砷或者三价砷处理下砷的形态发生着变化，但是五价砷是培养基中的主要形态，最终变为不明显的二甲基胂和单甲基胂。我们能够得出这样的结论：铜绿微囊藻内砷形态的转化几乎不受外界砷浓度的影响，尤其是在高浓度的砷污染下。