HBV

乙型病毒性肝炎3.5亿慢性乙肝病人我国HBsAg阳性率为9.09%每年1百万人死于肝衰或肝癌全球第9位死亡原因乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）病原学基因分型产品知识1963年首先在澳大利亚土著人血清中发现，称澳抗1968年称肝炎相关病毒1970年Dane发现HBV病毒相关颗粒，称Dane颗粒1983年将HBV归为嗜肝病毒科乙型肝炎病毒生物学性状大球形颗粒:又称Dane颗粒，是完整的HBV小球形颗粒:是病毒组装后过剩的衣壳蛋白管形颗粒：由小球形颗粒串连而成乙肝病毒的三种颗粒Dane颗粒形态：球形，42nm核心：环状双股不完全闭合的DNA和DNA聚合酶内衣壳：20面体立体对称，直径27nm，表面为HBcAg；HBeAg也产生于内衣壳外衣壳：相当于病毒包膜，包膜蛋白包括HBsAg，前S1，前S2是完整的HBV颗粒，具有感染性HBVnomenclatureHBV:hepatitisBvirusHBsAg:hepatitisBvirussurfaceantigenHBsAb:hepatitisBvirussurfaceantibodyHBcAg:hepatitisBviruscoreantigenHBcAb:hepatitisBviruscoreantibodyHBeAg:hepatitisBviruseantigenHBeAb:hepatitisBviruseantibodyHBV基因结构环状双股不完全闭合的DNA长链有4个开放读码框架，分别为：S区C区P区X区长链短链DNA聚合酶短链：为正链（长度可变），长度是长链的50％～100％长链：为负链（约3200bp）含HBV全部遗传信息S区：编码HBsAg和前S1抗原和前S2抗原C区：编码HBcAg和HBeAgP区：编码DNA多聚酶X区：编码HBxAg(可能与肝癌发生有关)吸附、穿入肝细胞脱壳转译外衣壳蛋白转译内衣壳蛋白前基因组复制子代核酸组装释放抗原组成HBsAg:以三种不同形式存在于患者血清中HBsAg亚型的分布有明显地区差异,并与种族有关血清HBsAg是感染HBV的重要标志HBsAg刺激机体产生的抗-HBs是中和抗体,对机体有保护作用HBcAg存在于Dane颗粒中不易在血液中检出可在感染的肝细胞表面存在刺激机体产生抗-HBc（IgG、IgM）血清抗-HBcIgM的检出，表明病毒在肝细胞中复制HBeAg存在于Dane颗粒中游离存在于血液中是病毒复制及强传染性的指标免疫性HBsAg：感染的标志HBsAb：既往感染/接种疫苗HBcAbIgM：急性感染标志HBcAbIgG：既往或慢性感染HBeAg：急性病毒复制，有传染性HBeAb：病毒不再复制血清学检测的临床意义HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb临床意义急性或慢性感染(大三阳)+-+-++++乙肝后期或慢性感染(小三阳)--++---潜伏期或急性乙肝早期--+++痊愈或恢复期,有免疫力-----+++--痊愈,有免疫力疫苗接种或曾经感染过,有免疫力其他生物学性状培养:◆黑猩猩是HBV最敏感的动物模型◆细胞培养尚未成功抵抗力:强◆能耐受低温、紫外线、干燥和一般消毒剂100℃10分钟、高压蒸汽灭菌、0.5％过氧乙酸等能使HBV灭活传染源患者潜伏期急性期慢性期无症状HBsAg携带者传播途径血源性传播输血、注射、外科和牙科手术、针刺等剃刀、牙刷和蚊虫叮咬等母婴垂直传播宫内传播分娩时微小皮损处传播产后母婴密切接触性传播治疗药物核苷类药物拉米夫定阿德福韦恩替卡韦干扰素0-8-6-4-2HBVDNA(log10拷贝/毫升)恩替卡韦替比夫定拉米夫定阿德福韦-6.9-5.4-6.5-3.6强弱HBV基因变异与临床治疗及愈后关系较为密切1、YMDD变异2、阿德福韦耐药变异3、恩替卡韦耐药变异4、替比夫定耐药变异5、1896变异YMDD变异病毒DNA编码的DAN聚合酶基因序列变异，在YMDD序列及其附近YMDD中M(Met)被V(Val)或I(Ile)替代可以自然变异Lamivudine治疗6个月以后，可能成为优势株用药时间越长，变异发生率越高停药后，野生株恢复为优势株阿德福韦变异Adefovir抑制HBVDNA复制，无副作用，口服（10mg）耐药株发生率低，出现迟对于YMDD野生型，抗毒能力远弱与拉米夫定外周血中游离病毒主要为耐药株，肝细胞内的cccDNA仍未YMDD野生型抗HBV治疗过程中出现的耐药变异RT236RT181治疗2年的耐药发生率为1.6%最近报道，治疗18个月时耐药率为14%，24个月时为22%更容易发生在已存在YMDD变异的患者与基因型相关，D型更容易耐药恩替卡韦耐药变异rtM204I或rtM204V、169L/M、184X、202G或205V/L，与拉米夫定存在交叉耐药已发生YMDD变异的患者，使用恩替卡韦耐药几率较大替比夫定耐药变异突变株与拉米夫定存在交叉耐药发生率较拉米夫定低治疗一年后，耐药性显著增强1896变异使用干扰素治疗，HBV前C区A1896的G突变为A，使TGG变为TAG，为前C区终止突变HBeAg缺陷变异株不能分泌合成HBeAg，血清HBeAg阴性而HBVDNA阳性病毒复制能力增强基因型根据ＨＢＶ全基因核苷酸序列异源性≥８％或者Ｓ基因区核苷酸序列异源性≥４％，将不同病毒株分为不同的基因型，迄今为止，ＨＢＶ可以分为８个基因型，即Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ和Ｈ型。基因型*地理分布A西北欧、北美、非洲B中国、东南亚C中国、远东D地中海区、印度、中东E西非F中南非、波利尼西亚G法国、美国HBV基因型和分布17.281.4533212.284.70%20%40%60%80%100%中国(上海）台湾日本其他基因型HBV基因型CHBV基因型B11.188.925502532.842.7232.517.281.41.4其它基因型B、C混合型C型B型沈阳北京广州上海我国A、B、C、D4个基因型都存在北方城市以基因C型流行为主，由北方至南方，基因B型感染率逐渐增高少数民族地区基因A、D型有较高的感染率，西藏则以D型为主。HBV基因型的临床意义HBV标志物清除病毒致病性乙型肝炎的病程及转归药物敏感性与血清型相比，基因型有更重要的意义HBV基因型和HBeAg的清除的关系与Ｂ基因型相比，Ｃ基因型有更高的HBeAg阳性率，分别为１６％与５３％。Ｂ基因型的自发性清除HBeAg要比C基因型早１０年，并且在HBeAg清除后，肝脏生物化学指标持续正常。HBeAg累积清除率HBV基因型与病毒致制病性的关系日本学者Shiina分析了1744例HBsAg阳性者的基因型与肝功能异常的关系后发现,与B基因型相比,C基因型的肝功能异常更为常见。C基因型引起的临床表现及组织学损伤更严重HBV基因型与肝硬化的关系HBV基因型和肝细胞癌的关系KAO等在进一步对67例无症状HBV携带,103例慢性肝炎,32例肝硬化,20例肝细胞癌患者进行基因分型研究中发现,各组均以B/C型为主,C基因型所占比例按上述顺序逐渐增大,而B基因型的比例逐渐减小;与B基因型比较,C基因型在肝硬化及50岁以上的肝细胞癌患者中比例较高,而B基因型与50岁以下,特别是35岁以下的肝细胞癌患者有关。HBV基因型与抗病毒药物敏感性的关系基因Ａ型和基因Ｂ型患者接受干扰素、拉米夫定治疗后，HBeAg血清转换率较高;而基因C型的HBeAg血清转换率较低。不同基因型HBV感染对干扰素治疗的反应有差别检测基因分型的常见方法基因测序法PCR-RFLPELISA生物芯片实时荧光PCR基因测序首先采用末端终止法，获得待检样本的核酸序列，通常按照国际惯例选择HBVS区基因进行扩增，获得HBVS区的序列，然后将该序列与国际基因库中HBV各个基因型的标准序列进行比对，建立亲缘树，分析待检HBV与何种基因型的遗传距离最近，即判断为该种基因型。PCR聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）1985年，美国科学家KaryMullis发明，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及中温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。荧光定量PCR荧光素淬灭剂与目标序列互补FAMTETJOEHEXVICTAMRADABCYL探针与目标序列配对时，发生FRET光能量转移Taq游离的探针荧光基团淬灭剂延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号Taq发出荧光光另一波长的荧光随着扩增循环数的增加，TaqMan探针释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系TaqMan探针应用基因检测、病毒定量、细胞因子基因定量、癌细胞基因微突变检测等其结果都具有高特异性与高敏感性实时荧光PCR准确性好:与核酸序列测定分型比较，两者结果吻合率100%有效防污染:PCR反应和分析在完全闭管条件下进行操作简单、耗时短、结果判断直观明确