人工酶

第六章人工酶天然酶的特点:价格昂贵(特别是需要辅因子的酶)使用时间短反应条件比较苛刻人工酶的特点:寿命长不需要辅因子价格便宜本章主要内容第一节人工酶的理论基础和策略第二节人工酶的分类第三节印记酶第四节人工酶研究进展第一节人工酶的理论基础和策略一、人工酶的概念二、人工酶的理论基础1.人工酶的酶学基础2.超分子化学人工酶属仿生学范畴神秘的生物体系是众多领域发明创造的源泉。酶在生命体系中扮演了最重要的角色！固氮酶固定空气中的氮所需条件比化学合成氨系统(温度480~520℃,压力200~300大气压)温和得多，充分证明生物酶的优越性。许多科学家曾进行过化学模拟固氮酶的研究，并取得一定效果。什么是人工酶？别称：模拟酶、模型酶。顾名思义：人工酶不是天然酶，是人工合成的具有催化性质的大分子。和天然酶不同处：分子结构较天然酶简单。和天然酶相同处：在分子水平上模拟天然酶活性部位的形状、大小及微环境等结构特征，模拟天然酶的作用机理和立体化学等特性。一般是以高分子化合物、高分子聚合物(或络合了金属的)为母体，在适宜的部位引入相应的疏水基，形成容纳底物的空间，并在适宜的位置引入担负催化功能的催化基团。人工酶学科的诞生和发展诞生基础：1、化学合成技术的高度发展;2、越来越多的蛋白质(酶)结构和功能关系得到阐明;3、化学家对生物现象的浓厚兴趣目前状况：小分子仿酶体系：环糊精、冠醚、环番、环芳烃、卟啉等；大分子仿酶体系：聚合物酶模型、分子印记酶模型、胶束酶模型、半合成人工酶、抗体酶等。人工酶的理论基础酶学基础(pauling的稳定过渡态理论):酶和底物定向结合－稳定的过渡态(活化能最低)－催化产生产物(酶高效的原因)超分子化学和主客体化学：(天然酶＋底物)通过非共价键形成“超分子”(具有分子识别、催化、选择性输出的稳定大分子)。天然酶是主体，底物是客体。化学家可以通过酶活性的模拟，或酶作用机制的模拟，人工合成类酶物质，即人工酶(主体)，和人工酶反应的反应物是客体。主体和客体互补：在结合部位的空间及电子排列上主、客体应互补！(主体＋客体)形成超分子。20世纪著名科学家，两次诺贝尔奖(化学奖和和平奖)获得者。著名的pauling轨道理论是他对有机化学的杰出贡献。如何设计人工酶？设计前的工作：1.应了解所要模拟的酶的活性中心－底物复合物的结构；2.酶的专一性及其同底物结合的方式与能力；3.反应动力学及各中间物的性质设计人工酶时应注意哪些？1.人工酶应为底物提供良好的微环境，便于与底物，特别是与过渡态以离子键、氢键等结合；2.精心挑选的催化基团必须尽可能同底物的功能团相接近，以促使反应定向发生。3.人工酶应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性。第二节合成酶人工酶按属性，可分为：一、主－客体酶模型：环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物、卟啉等二、胶束酶模型三、肽酶四、半合成酶环糊精(CD)酶模型由6~8个D-葡萄糖以1,4-糖苷键连接的环状锥形圆筒,CD可以合成，也可以由微生物生产。羟基伸出筒口，故外侧亲水，可与多种客体形成氢键；内腔疏水，能包结多种客体分子(类似酶识别底物)。环糊精和底物结合常数小于酶，修饰后可达到酶和抗体的结合水平。修饰环糊精1－水解酶的模拟A：在环糊精引入酰基酶催化部位，酯(叔丁基苯基乙酸酯)水解能力提高1倍。B：引入咪唑基，酯水解能力高一个数量级(10倍)。C：底物修饰(二茂铁、金刚烷修饰的硝基苯酯底物)，CD作为催化剂，水解能力提高10~100万倍。修饰环糊精2－核糖核酸酶的模拟反应：环状磷酸二酯的水解，两种产物II和III。碱水解:两种产物。A：两个咪唑基修饰的环糊精作催化剂，产物是III。B：修饰剂不同于A，催化产物也不同于A，即主要是II。修饰环糊精3-转氨酶的模拟转氨酶：催化酮酸和氨基酸之间的转氨。吡哆胺：转氨酶辅酶，单独可转氨，不如酶存在时快。A：多了一个吡哆胺，转氨反应快200倍，同时因CD具手性，产物氨基酸有D、L两种构型。B：又多了乙二胺，催化速度又提高2000倍。且立体选择性更强(乙二胺附近质子转移受抑制)。环糊精仿酶模型4—桥联CD近年来发展起来的一类新型仿酶模型两个CD及桥基上的功能基构成了具有协同包结和多重识别功能的催化活性中心，使得人工酶能更好地完成对底物的识别与催化功能。Matsui等将乙二胺偶联到CD上，然后与铜盐作用形成桥联环糊精.它催化糠偶姻(B)氧化成糠偶酰的反应，其催化速率Kcat比没有催化剂时大20倍。机制：两个CD协同包结糠偶姻的两个呋喃环，同时糠偶姻的烯醇负离子通过与桥基铜离子的静电或配位作用得以稳定，从而加速了反应。图6-6桥联环糊精仿酶模型胡萝卜素利用桥联环糊精氧化为视黄醛胡萝卜素视黄醛合成的主－客体酶模型环糊精是天然的主-客体酶模型。冠醚、穴醚、环番、环芳烃等是合成的主-客体酶模型。右上图的主体部分是“冠醚”，并带有巯基(和半胱氨酸类似)，是个仿酶模型。在此模型内可合成二肽。右下图是含有半胱氨酸残基的大环手性人工酶，可与伯胺盐络合，使二肽酯水解提高103~104倍。窝穴体－含氮大环聚胺24元大环，其中6N、2O、16C。象窝一样凹下去。－NH－上的N由于电负性强，易质子化，易和带负电的多聚磷酸离子结合。此化合物可催化ATP水解为ADP和AMP。pH7时水解提速500倍。-胰凝乳蛋白酶模拟A：-胰凝乳蛋白酶模拟物，是含B的具有孔隙状结构的球状配体，由环状尿素连接而成的孔穴状结构，方便与底物结合。B：催化底物进行酰基转移反应的亲核试剂。A催化底物反应的速度是B的1011倍。二、胶束人工酶胶束人工酶：表面活性剂形成的胶束，在水溶液中提供疏水微环境，类似于酶的结合部位，利于束缚底物，胶束上还可以结合咪唑、巯基、羟基、辅酶等催化基团，等于提供了“活性中心”。胶束本身就成为具有酶活力或部分酶活力的人工酶。和反胶束酶的区别：反胶束酶：反胶束里面“包”着“真正的酶”；胶束人工酶：胶束本身就起着酶的作用，没有“包”真正的酶。模拟水解酶的胶束人工酶结构：许多表面活性剂偶联到一起，成了很大的“单分子”。疏水空腔中结合了“催化基团”。特点：既适合底物结合，又接近催化基团，因此，催化效率高(高几千成万倍)。其它胶束人工酶辅酶的胶束人工酶：如阳离子胶束和VB6(辅酶)混合形成泡囊体系，在铜离子存在下，可模拟转氨酶，将酮酸转化为氨基酸。金属胶束人工酶：由表面活性剂加金属离子组成。表面活性剂营造疏水微环境可以包结底物，金属离子起催化作用。三、肽酶(pepzyme)本质：人工合成的多肽。特点：具有所模拟的天然酶的活性部位。合成：先通过各种方法弄清天然酶的结构，特别是活性部位的组成。合成时不必完全仿造天然酶，除活性部位不能替换外，其它部分可以适当简化(前提是维持活性部位构象，得到理想酶活)。四、半合成酶定义：将具有一定结构和功能的物质与特异的蛋白质结合，所形成的一类新的生物催化剂，叫半合成酶。合成方法：1.将具有催化活性的金属或金属有机物与具有特异性的蛋白质相结合；2.将具有特异性的物质与具有催化功能的酶相结合。第三节印记酶概念：以一种分子充当模板，共周围用聚合物交联，当模板分子去除后，此聚合物就留下了与此分子相匹配的空穴。如果构建合适，这种聚合物就像“锁”对钥匙有选择性识别作用一样，这种技术就称为印记。(一)分子印记技术原理印记技术放大了很像由钥匙造锁。先做好模子(钥匙或类似物)，再用金属材料浇铸成锁。模子是单分子(印记分子P)，单体交联后得到分子印记聚合物(MIP)。“印记分子P”和MIP之间不仅空间互补，而且多点反应互补。抽去印记分子，MIP留下和印记分子完全一样的空穴。当重新碰到印记分子或类似物时，马上严密契合。印记技术中的几个元素印记分子P：要分离分子(底物)的类似物、衍生物。单体：有和P反应的基团及相互交联的基团。烯酸类、烯碱类、烯酰胺等。交联剂：具多官能团。如季戊四醇三丙烯酸酯。溶剂：影响非共价键结合的强度和MIP的形态。溶剂极性越小，MIP分辨率越好。聚合和识别用溶剂应相同。制备MIP的过程选择印记分子和功能单体，使二者能发生共价或或非共价反应，形成可逆复合物。在印记分子和交联剂存在下通过光和热启动单体之间的聚合作用；研磨聚合物提高分离容量；抽提印记分子(所用溶剂不能溶解MIP)；得到选择性(对该印记分子特异亲和)的聚合物MIP。1.印记分子和单体相互作用模型应用分子印记时可遵照两种方法：一是印记分子与单体是共价可逆结合的。1972年分子印记提出后，初期主要是用这种方法，它促进了分子印记技术的发展。二是印记分子与单体之间的最初反应是非共价的。非共价法的优点是可以使用不同单体的“合剂”，扩大了分子印记的使用范围。而且可以用离子、氢键、疏水的和电荷转移等相互作用使这种方法简化。这两种方法都使用了基于苯乙烯、丙烯酸和二氧化硅的聚合物。印记分子和单体共价可逆结合印记分子是D型甘露糖衍生物。单体是4－乙烯基苯基硼酸。二者形成共价复合物。乙二醇二甲丙烯酸酯(EDMA)是交联剂。酸可以水解掉印记分子，留下的MIP只和DL外消旋体中的D型结合，所以在混合物装柱洗脱时，L型先被洗脱下来，D型因被结合后被洗脱，二者分得很清楚(峰谷很低)。拆分外消旋混合物本来是酶的功能，因此，MIP实际上起了酶的作用。所以叫做印记酶。2.影响MIP选择性识别的因素印记了的MIP对于对映体的选择性可以用分离因子(在溶液和聚合物之间的分配系数之比)来表示,值越大，选择性越强。影响值的因素主要有四个:底物必须与印记分子的结构、大小相似，否则影响分辨力。MIP和印记分子之间的作用力越强(多种力，且数量大)，分辨率越高。交联剂用量少，MIP的空间形状容易变化，分辨率不会高。交联度一般在80%以上较好。交联剂如果有旋光性，则可以提高MIP的分辨率。聚合温度也有影响，一般温度低一些较好。常用印记分子、单体及体系药物、氨基酸、碳水化合物、核酸、激素、辅酶等，均已成功地用于分子印记的制备中。聚合单体主要有羧酸类(如丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基苯甲酸)、磺酸类以及杂环弱碱类。常用的聚合体系为聚丙烯酸和聚丙烯酰胺体系。3.MIP的优点和局限性优点:因为是化学交联聚合物，化学稳定性、热稳定性、机械稳定性相当好；成本低(相对其它识别系统)；印记分子可回收，MIP可重复使用；可以创造自然界不存在的新催化剂。局限性:容量低；印记分子要求纯度高(特别是对映体中的一种)，获得比较困难。生物印记酶特点：“MIP”由化学材料换成生物材料，如蛋白质等(包括酶和普通非酶蛋白质)。印记分子：酶的抑制剂、底物类似物、过渡态类似物等。由这些分子印记出来的MIP具有酶的性质。原理：生物材料在水中有柔性，可通过氢键等作用和印记分子很好识别，形成新的特定构象；此构象在无水有机溶剂中可得到保持。除掉印记分子的生物材料的构象再回到水中时，特定构象破坏。做法：在水溶液中让印记分子和生物材料充分接触，形成复合体。然后将复合体冷冻干燥。脱除印记分子后，便得到生物印记酶。制备非水相生物印记脂肪酶未印记时特点：水溶性脂肪酶因有一个“盖子”呈非活性状态。在水中，用表面活性剂打开了这个“盖子”。为了保持“盖子”的“开启”状态，冻干，用无水溶剂洗去表面活性剂。在有机相中保持“开启”状态的脂肪酶是印记后的酶，有活性。催化效率比印记前提高100倍。第四节人工酶的研究进展发达国家将人工合成具有高性能的人工酶列入研究计划，我国也列入高技术、新概念、新构思探索性课题。从只注意催化功能模拟到同时注意底物结合功能的模拟，人工酶研究的水平迅速提高，部分人工酶已能和天然酶相媲美。但是，大多数人工酶的活性还不够高。人工酶的方法不仅限于化学手段，还有生物手段(即基因工程、蛋白质工程方法)。应用分子印记技术，目前已经成功制备出具有水解、转氨、脱羧、酯合成、氧化还原等活性的分子印记酶。生物印记酶的出现为分子印记酶