色谱基础知识及原理

关于色谱色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器常见的分离方式：蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤等等色谱是其中一种分离工具色谱法简介色谱法（Chromatography）溯源俄国科学加1903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献1906年正式命名（见诸文献）色谱法；Chromatography30年代开始广泛研究和应用主要是气相色谱及薄层色谱高效液相色谱法的广泛应用始于70年代色谱的发明人俄国科学家：M.S.Tswett正式命名“色谱”的文献色谱分离的机理分离是一个物理的过程流动相（MobilePhase）固定相（StationaryPhase）样品（溶解于流动相中的溶质）什么是液相色谱色谱液相色谱柱色谱纸色谱薄层色谱高效液相色谱HPLC气相色谱气相色谱：流动相是气相液相色谱：流动相是液相什么是高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱法，简称：HPLC是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器……广泛应用于各个领域：医药/环保/石化/生命科学/食品及农业……在技术，理论及应用上仍处于发展阶段HPLC的仪器配置及流程溶剂色谱泵自动进样器HPLC色谱柱检测器废液数据处理系统HPLC的仪器配置及流程色谱泵自动进样器色谱柱及柱温箱检测器数据处理系统溶剂色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。←色谱峰保留时间（分）基线↓峰高峰宽液相色谱图相关术语色谱峰－Peak色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线峰底－PeakBase峰的起点与终点之间连接的直线峰高－PeakHeight峰最大值到峰底的距离峰宽－PeakWidth在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半（高）峰宽－PeakWidthatHalfHeight通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离液相色谱图相关术语峰面积－PeakArea峰与峰底之间的面积,又称响应值标准偏差；σ－StandardError0.607倍峰高处所对应峰宽的一半拖尾峰－TailingPeak后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰－LeadingPeak前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰－GhostPeak并非由试样所产生的峰；亦称假峰液相色谱图相关术语基线－Baseline在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线基线飘移－BaselineDrift基线随时间定向的缓慢变化基线噪声；N－BaselineNoise由各种因素所引起的基线波动谱带扩展－BandBroadening由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象液相色谱图相关术语死时间，t0－Deadtime不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间保留时间，tR－Retentiontime组分从进样到出现峰最大值所需的时间死体积，V0－Deadvolume不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积保留体积，VR－Retentionvolume组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积液相色谱应用：制备型液相色谱分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用对分离及纯化的要求化合物的稳定性样品的复杂性制备量的要求纯度的要求，及纯度的鉴定方法的安全性液相色谱应用：分析型液相色谱定量分析主要基于与标准品的比较是其最大应用领域定性分析；不是色谱的强项基于样品的保留时间比较借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器对定量及定性分析的要求灵敏度、精度及准确度的要求样品量的要求；复杂样品的分析能力容易使用液相色谱原理－基本概念及方法开发液相色谱实验所需的基本参数流动相：种类及配比，等度或梯度固定相：色谱柱类型及内径、长短流动相输送系统参数：流速检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等温度控制进样量以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件评价液相色谱方法的标准问题：什么样的分离结果是好的？分离度？什么是色谱的分离度分离度的公式：)(211212WWVVRR：分离程度的量度影响分离度的因素：K’、α及N分离度方程：K‘是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱α是分离因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素N是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度411''NkkR若N增加2倍或3倍,R会如何变化?1141RN分离度方程解析：柱效项N＝理论塔板数：分离效率的量度1600N.5516NWV16N22100N2516NWV16N22PW=.5PW=2色谱柱的柱效N理论塔板数计算公式：Ws方法Wtan16切线法Wh5.54半峰高W3s93sW4s164sW5s255s21WVNs峰宽与塔板数的关系2000400060008000050100150200250300理论塔板数峰宽（L）k＝2，Vo＝1000L塔板数与流速的关系流速（cm/min）塔板数×103123456789101112131415051015变化结果塔板数%NN73%54.730003000N41%44.720002000N31.610001000N73%122.415,00015,000N41%10010,00010,000N70.75,0005,000N分离度与N的关系1N41R1分离度方程解析：分离因子项若=1.1or1.4，R会如何变化？＝分离因子：峰分离程度的量度VVVVk'k'01021V2V或3.5-1.5-22V9.5-1.5-53VV1V2V3V0时间0.5125分离因子：α定义：=1时两组分分不开，改变的途径改变固定相或改变流动相改变温度改变样品的本身性质120102''kkttttRR1R通过改变流动相改变α，同样强度的不同溶剂改变色谱柱改变分离因子α的例子①②③62:38/42:58/72:28/2322＝③＝②＝①OHCNCHOHMeOHOHTHF若=1,2,10or20,R会如何变化?1N141R分离度方程解析：容量因子项K＝容量因子：保留能力的量度0011VVVk'1.5.5-1k'1V9.5.5-5k'3VV0V1V2V3时间0.5125k值k项k对分离度影响00011/2.5022/3.6733/4.751010/11.912020/21.95容量因子k与分离度的关系与R的关系容量因子k与峰高的关系改变k’值的方法：调节流动相的极性、pH、离子强度等梯度淋洗改变容量因子K’的例子60/4050/5040/60①②③①②②③③①谱图α、k’及N如何控制分离度液相色谱原理－更进一步的探讨离子型化合物的分离方式多数化合物是离子型的！使用离子交换柱：离子交换法主要用于“强”阴、阳离子使用反相柱离子抑制色谱法：通过改变流动相的pH值，使样品成中性离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中性离子抑制色谱离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离主要适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的pH值，使样品降低离子化使用硅胶基质C18填料使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内离子抑制色谱实例而在乙腈/水并且pH=7时，多数组份保留时间很短，无法完全分离。CHOOHOCH3COONaCHOCOOHOCH31234离子抑制色谱的使用范围下列情况下不能使用离子抑制方法，如果：一些酸在pH低于2时还保持离子化一些碱在pH高于7时还保持离子化可以有以下的选择离子交换色谱使用聚合物或其他耐碱性流动相的反相柱，在pH高于7时用离子抑制法使用“离子对色谱法”在高pH值下用离子抑制色谱柱：D18-613(聚合物基质)，室温流动相：乙腈/0.01MNH4OH+0.01MTBA流速：1.0ml/min检测：UV-240nm样品：巴比妥的衍生物①巴比妥②己琐巴比妥③甲基苯巴比妥④速可巴比妥离子对色谱法在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂与样品中可电离的组份形成“对离子”在反相色谱柱上分离离子型化合物离子对试剂的类型：磷酸季丁铵（PICA），适用于弱酸烷基磺酸盐（PICB），适用于弱碱烷基长度不同，形成对离子的能力不同通常有：B5，B6，B7，B8–后面的数字是碳链的长度磷酸二丁胺（PICD4），适用于弱碱离子对色谱机理使用五烷基磺酸盐Packing:BondapakC18Column:4mmIDx30cmSolvent:Methanol/H2Owith0.005MPENTANESulfonicAcid&1%HOAc(50/50)FlowRate:2.0ml/minDetector:UV,254nm,0.1AUFS1.MaleicAcid2.Phenylephrine-HCl3.Phenylpropanolamine-HCl4.Naphazoline-HCl5.Phenacetin6.PyrilamineMaleate使用六烷基磺酸盐Packing:BondapakC18Column:4mmIDx30cmSolvent:Methanol/Waterwith0.005MHEXANESulfonicAcid&1%HOAc(50/50)FlowRate:2.0ml/minDetector:UV,254nm,0.1AUFS1.MaleicAcid2.Phenylephrine-HCl3.Phenylpropanolamine-HCl4.Naphazoline-HCl5.Phenacetin6.PyrilamineMaleate用离子对、还是用离子抑制方法？开发液相色谱方法的考虑因素分离度是色谱分离中主要考虑的因素除分离度之外，在开发色谱方法时，以下几个因素也都要考虑：灵敏度载样量分析速度溶剂损耗成本容易使用色谱柱寿命效率基本的HPLC系统溶剂色谱泵自动进样器HPLC色谱柱检测器废液数据处理系统色谱泵及液相色谱对泵的要求稳定平滑并且重现性好的流速可靠且充分的溶剂混合准确及重现的自动溶剂混合准确及重现的梯度形成有效的流速范围制备色谱或微柱、窄柱色谱更为关注滞后体积仅仅应用于梯度实验目的：在任何情况下保持最高精度梯度：高压混合高压梯度使用多台色谱泵，在泵后混合配置灵活、简单，脱气简单易调节梯度的滞后体积梯度：低压混合低压梯度用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合对脱气要求高不易调节梯度的滞后体积如设计不当，梯度的准确性受影响滞后体积（系统体积）设计合理梯度滞后：系统体积的影响死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意∶滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路比例阀检测器进样器ABCD色谱柱溶剂输送系统(泵)低压梯度阻尼器混合器梯度滞后大小的影响滞后体积太大会引起梯度变化的延迟例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min实际梯度会比设置值晚2分钟响应，没有问题对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min实际梯度会比设置值晚20分钟响应，不能接受滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现滞后体积的变化会导致梯度重现性不好普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml滞后体积变化的影响设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化滞后体积随反压变化的后果：梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯