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2016年05月30日发布2016年07月01日实施CNAS-GL41临床微生物检验程序验证指南GuidanceontheVerificationofProceduresusedintheClinicalMicrobiology中国合格评定国家认可委员会CNAS-GL41:2016第1页共13页2016年05月30日发布2016年07月01日实施前言本文件由中国合格评定国家认可委员会（CNAS）制定，是对CNAS-CL02：2012《医学实验室质量和能力认可准则》和CNAS-CL42:2012《医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明》中有关临床微生物检验程序验证所做的具体解释和指导，供医学实验室和评审员参考使用。本文件的附录A和附录B为资料性附录。本文件为首次发布。CNAS-GL41:2016第2页共13页2016年05月30日发布2016年07月01日实施临床微生物检验程序验证指南1范围本指南适用于申请认可或已经认可的医学实验室规范其临床微生物检验程序验证的技术活动，也可供认可评审员在评审过程中使用。本指南主要适用于医学实验室临床微生物检验，其他领域的实验室可参考使用。临床微生物检验程序，也称临床微生物检验方法，在本指南中统一称为临床微生物检验程序（以下简称“检验程序”），包括显微镜检查、分离培养和鉴定、药物敏感试验等各项检验活动。2引用文件3术语和定义4检验程序验证4.1在常规应用前，应由实验室对未加修改而使用的已确认的检验程序进行独立验证。实验室应从制造商或方法开发者获得相关信息，以确定检验程序的性能特征。实验室进行的独立验证，应通过获取客观证据（以性能特征形式）证实检验程序的性能与其声明相符。验证过程证实的检验程序的性能指标，应与检验结果的预期用途相关。细菌鉴定和药敏系统的验证，应按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或其它已知菌株对商业鉴定系统（包括自动、半自动、手工）每种板（条/卡/管）的鉴定/药敏结果符合性进行验证。注：已确认的检验程序是经国家卫生管理部门批准的体外诊断医疗器械使用说明书中规定的程序，或国际公认标准或指南中的，或国家、地区法规中规定的程序。4.2实验室应根据分析类型和用途进行验证程序的设计、验证结果的统计学分析、建立新检验程序的可接受性能标准。验证结果应证明该检验程序可用于检测或准确分析待测物的特点，通常验证计划和可接受标准应在验证开始前确定。验证计划和可接受标准应与该分析物相关的国家/行业标准/权威出版物等保持一致。定义可接受标准的方法之一是根据医学和临床要求确定总允许误差，但通常应用于定量检测。定性检测的可接受标准可以用一致性（符合率）表达。CNAS-GL41:2016第3页共13页2016年05月30日发布2016年07月01日实施检验程序验证所使用的标本应为合格的临床标本或从回顾性/前瞻性临床标本中分离的菌株。标本的采集应符合国家、地区法规要求。已通过一种或多种方式确定性能的标准菌株或质控品（如国家或地方临床检验中心使用过的质控菌株）也适用。在少数情况下，对大量标本进行统计学分析时除了需要临床患者标本，还可能会用到存档和/或回顾性标本。另外，类似的标本可通过使用添加基质的标本和标准菌株获得，不建议只使用标准菌株进行验证。可在阴性标本中添加不同浓度的分析物以获得模拟阳性标本。4.3显微镜检查显微镜检查程序包括涂片制备、染色镜检和结果报告过程。实验室在开展各种类型显微镜检查（如革兰染色、抗酸染色、墨汁染色等）前应对本实验室使用的检验程序进行验证，并由经培训有涂片镜检能力的实验室人员操作。检查方法可包括手工染片法和自动化染片法。所有样品及其盛放容器均应当作有传染性物质，并按照实验室生物安全要求进行操作。4.3.1验证要求显微镜检查程序的验证应包括能力验证/实验室间比对和实验室内人员比对（当多名人员从事该项目时）。如果没有可获得的能力验证或室间质评，实验室应自行组织实验室间比对（宜与通过认可的实验室比对）。若实验室同时开展手工染片法和自动化染片法，应进行两种方法的实验室内部比对。4.3.2比对方案4.3.2.1样品数量每项检查应使用至少5份样品进行验证，覆盖全部样品类型，无菌样品类型包含阴性和阳性结果。实验室应优先使用已知结果的留样样品，当不可获取时可采用模拟样品。4.3.2.2检验程序按临床标本常规方式处理,由本岗位工作人员使用实验室检验程序进行涂片制备、染色、镜检、判读。4.3.2.3结果报告根据实验室程序文件规定进行结果报告，其中抗酸杆菌应根据“分级报告标准”报告镜检结果。4.3.3可接受标准每项检查的比对结果符合率≥80%。4.4分离培养4.4.1血培养血培养检验程序包括从病人血液采集、运送、接收、孵育及监测的全过程。目前临床实验室广泛使用全自动血培养系统。临床微生物实验室血培养系统性能验证的主要CNAS-GL41:2016第4页共13页2016年05月30日发布2016年07月01日实施目的是评估系统使用的培养基能否用于培养临床常见微生物（包括酵母菌、厌氧菌、苛养菌等）以及仪器（自动化系统）能否及时检测出血液中的大部分病原菌。血培养性能验证常用留样验证和血培养系统平行比对两种方法。血培养系统平行比对用于评估验证系统和参比系统检出细菌能力的一致性，但需要样本量大，临床采样有难度。留样验证的优点则在于可评估其检测不常见病原菌的能力。实验室可根据医院病人数量和地区、病种特征等具体情况和两种方法的特点选择其中一种适宜的验证方法，或两种方法同时应用。4.4.1.1留样验证4.4.1.1.1验证要求验证应覆盖临床常见微生物,需氧成人/儿童血培养瓶验证菌株应包括需氧/兼性厌氧革兰阳性菌、需氧/兼性厌氧革兰阴性菌、苛养菌（如：流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等）和真菌，厌氧血培养瓶验证菌株应包括兼性厌氧革兰阳性菌、兼性厌氧革兰阴性菌、专性厌氧菌，其他特殊用途血培养瓶参照厂家要求选择合适类型菌株进行验证。每种类型至少１株，总体不少于15株。应尽可能使用真实患者的临床分离菌株（性能验证用临床留样菌株宜经质谱或DNA序列分析确认）。对于特殊、苛养菌可使用标准菌株或质控菌株。某些特殊菌株需要在培养瓶中加入无菌、未使用抗生素的厂家推荐血液标本，如不加可能不生长，如流感嗜血杆菌。4.4.1.1.2验证方案模拟临床血流感染患者的细菌含量，用留样菌株进行一系列稀释，接种细菌的最终浓度为5-30CFU/瓶。若苛养菌需添加适量的新鲜无菌血液（成人瓶5-10ml，儿童瓶1-3ml）后置于血培养系统上进行培养、检测。4.4.1.1.3可接受标准如果在厂家说明书规定时间内检测出所有菌株则该方法通过验证。3天时间应足以检测出至少95%的临床相关细菌，须具备苛养菌、真菌、厌氧菌等的检出能力。若未能检出应使用相同菌株进行重复试验来验证。若仍不能检测，实验室和/或制造商应在临床使用该系统前采取纠正措施。如果血培养仪升级，原系统和新系统的差别不大，培养瓶也没有改变，那么由供应商技术代表核查仪器性能即可，无需再次验证。功能核查将对孵育系统和光学系统以及软件是否按照制造商规定运行进行评价。4.4.1.2血培养检测系统比对4.4.1.2.1验证要求因血培养检测系统比对要求较高，并非强制要求执行。同一厂家由同一系统控制采集数据的多个血培养模块不需进行比对。检测系统比对允许根据患者情况和实验室条件来评价新系统的性能，通常比对所需临床标本数量应≥100例。4.4.1.2.2验证方案CNAS-GL41:2016第5页共13页2016年05月30日发布2016年07月01日实施同一病人按照同样的采血方法采集血液标本，接种验证血培养瓶和参考血培养瓶中，分别放入各自的培养系统上进行培养、检测。4.4.1.2.3可接受标准与参考方法相比，新培养系统检测符合率至少为95%。如果未能满足性能要求,则该实验不能通过验证或者制造商和/或使用者须采取正确的纠正措施并再次进行验证。4.4.2一般培养（非血液标本）一般培养包括各类标本（痰液、尿液、粪便、分泌物、组织等）的细菌（含厌氧菌、结核分枝杆菌）、真菌、支原体等的培养。培养程序包括标本处理、接种、培养基选择和适宜培养条件(温度、气体等)。实验室在开展各种类型标本微生物培养检验前应针对培养目的对本实验室使用的检验程序进行验证。如果没有可获得的能力验证或室间质评，实验室可采用培养基验证方法对培养程序进行验证。使用质控菌株或留样菌株模拟标本进行培养，验证该培养程序是否满足检出性能要求。4.4.2.1验证要求每项检查每种样品类型至少1份标本。培养基根据其用途主要分为两种：选择性培养基和非选择性培养基。选择性培养基包含能够抑制某些微生物生长的抗生素或化学试剂，非选择性培养基则不含抑制微生物生长的物质，能够促进大多数微生物的生长。无论商品化培养基还是自配培养基，都需要在使用前对培养基性能进行验证，验证菌株可选择质控菌株或临床菌株。对于某些苛养细菌专用培养基，实验室必须确定该培养基能保证对应苛养细菌的生长。如：厌氧菌、百日咳博德特菌、弯曲菌、螺杆菌、军团菌、淋病奈瑟菌、以及其他需要特殊生长条件的细菌。而对于一些非选择性培养基，如血平板和巧克力平板需保证其能支持大部分细菌的生长。4.4.2.2验证方案标准菌株、能力验证/室间质评活动使用的菌株、从临床病人标本分离的具有稳定表型的菌株均可用做验证菌株，实验室对其生化特征及鉴定结果应做好相关记录。4.4.2.2.1直接接种法按照实验室细菌分离培养SOP直接接种菌株至培养基上，观察细菌生长情况。如果使用直接接种，应谨慎操作。接种菌量过多或者过少都将掩盖培养基的促进或抑制生长的特性。如果在使用直接接种法时出现验证不合格，则改用标准化菌悬液进行验证。4.4.2.2.2标准化菌悬液法不同实验室之间可进行标准化菌悬液验证比对。较高浓度的菌悬液能够较好测试选择性培养基抑制特定微生物生长的能力。较低浓度的菌悬液则能够验证非选择性培养基充分支持细菌生长的能力。第一步：菌悬液的准备CNAS-GL41:2016第6页共13页2016年05月30日发布2016年07月01日实施（1）直接菌落法：使用培养18到24个小时的菌落，在0.85%无菌生理盐水中制成菌悬液，使其浊度达0.5麦氏浊度。（2）生长法：从24h培养物中接种3到5个菌落至无菌肉汤以此制备悬浮液。孵育数小时使其浊度达0.5麦氏浊度。第二步：接种（1）验证非选择性培养基用无菌肉汤或者生理盐水将0.5麦氏单位菌悬液进行1:100稀释，每个测试平板接种10μl（0.01ml）悬浮液，均匀涂布。如果菌落过密，则可将菌液稀释1000倍后再接种。（2）验证选择性培养基用无菌肉汤或者生理盐水将0.5麦氏单位菌悬液进行1:10稀释，每个测试平板接种10μl（0.01ml）悬浮液。如果菌落过密，则可将菌液稀释100倍后再接种。（3）验证培养管用10μL（0.01mL）未稀释的0.5麦氏浊度悬浮液进行接种。培养温度、气体条件和培养时间执行实验室SOP文件规定。4.4.2.3可接受标准4.4.2.3.1在选择性培养基上验证菌株长势良好、菌落大小与预期相符、菌落形态典型，并且能够抑制特定微生物的生长，可判定性能符合要求，验证合格。4.4.2.3.2在非选择性培养基上验证菌株长势良好、菌落大小与预期相符、菌落形态典型，血培养基上的溶血类型符合，可判定非选择性培养基验证合格。4.4.3活菌计数临床微生物实验室需对中段尿、肺泡支气管灌洗液等标本进行活菌计数。活菌计数定量培养除验证对病原菌的分离能力外，还需对定量接种环进行验证。定量接种环不如微量加样器准确，但仍不失为半定量培养或者稀释的一种很好的方法，在允许20%误差存在时可以使用定量接种环。4.4.3.1验证要求定量接种环使用前应进行验证（使用微量加样器只需计量检定），一次性定量接种环每批次应抽样验证。4.4.3.2验证方案可以采用钻头法和浸染法两种方法，钻头法适用于重复使用金属环，浸染法适用于重复使用金属环和一次性接种环。浸染法较易于实施，方法如下：第一步：配制Evansblue染液（EBD）。