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《细胞周期》★细胞的最终命运：细胞分裂及生长（相关物质准备）→细胞增殖（受到严密的调控机制所监控）→细胞死亡★标准的细胞周期：（从G1期开始，历经S、G2，到M期结束）一．细胞周期的基本概念：1.细胞周期：细胞周期是细胞增殖周期的简称，指细胞从分裂结束后开始生长，到再次分裂终了所经历的全过程。2.细胞周期时间(Tc)：细胞周期时间因细胞类型、状态和环境而异，变异范围大，从0h~数年都可能。3.细胞的增殖特性（机体细胞的状态）：1）增殖细胞（周期性细胞）：能够增殖，不断进入周期完成分裂。2）暂不增殖细胞（休眠细胞，G0细胞）：长期停留在G1晚期（G0期）而不越过限制点，未丧失分裂能力，在适当条件下可恢复到增殖状态。3）永不增殖细胞（终末分化细胞）：始终停留在G1期，失去增殖能力直到衰老死亡。二．细胞周期的研究方法：★细胞周期模型细胞周期研究中经常使用一些典型的物种和细胞系统，最常用的模型包括酵母、爪蟾胚胎细胞和哺乳动物体外培养细胞。★细胞周期同步化——由于实验常常需要设法获得时相均一的细胞群，使样品中的细胞都处于大致相同的细胞周期阶段，所以常需要使细胞周期同步化。同步化的策略：①诱导同步化；②选择同步化同步化常用方法：①细胞分裂收获法②代谢抑制法（加入过量胸苷后清洗）③低温培养法★3H-TdR（氚标记胸苷）有丝分裂标记法（测定细胞周期的时间）——应用3H-TdR短期饲养细胞，数分钟至半小时后，将3H-TdR洗脱，置换新鲜培养液并继续培养。随后，每隔半小时或1小时定期取样，作放射自显影观察分析，从而确定细胞周期各个时相的长短。①通过在光镜下定期计算细胞的数目，并记录全部细胞数目增加一倍所需时间，从而估算出细胞周期的总时间②S、M期的时间可以通过添加氚标记胸苷到培养液中进行测定。★流式细胞技术三．细胞周期检验点(checkpoint)：——检查点是指检查和抑制细胞周期进程的一些特定信号通路，可以检查细胞周期事件的完成情况，控制细胞周期的进度，确保基因组复制和染色体分离的时空独立性，并使细胞能够适应环境变化和机体发育的各种需要。★G1晚期的R点(限制点)：R点是G1期细胞能够顺利进入S期的关键，R点受许多因素的影响。其中，生长因子的存在是细胞越过R点的必要条件。机制：生长因子信号途径。★DNA损伤检验点：DNA损伤检查点可以在DNA受损时阻止复制的启动或终止复制，为DNA修复赢得时间。机制：P53依赖途径和非P53依赖途径（P53：多功能转录因子，可以激活Cdk抑制因子P21的基因表达，还可以诱导细胞凋亡。正常情况下P53寿命很短，活性很低，这是因为大多数P53被Mdm2带出细胞核被降解，但在DNA损伤时，激酶ATM/ART可使Mdm2磷酸化而五花结合P53。同时P53也被磷酸化激活并促使P21表达，结合抑制Cdk，使细胞停滞在G1期。）★G2∕S期的DNA复制检验点：DNA复制检验点可检测DNA是否完整复制，以及是否被多次复制。DNA复制检验点持续作用于S期和G2期，使Cdk1保持磷酸化，不能启动M期。DNA损伤严重时，DNA复制检验点将启动细胞凋亡过程。机制：类似于DNA损伤检查点的非P53依赖途径。★中期∕后期的纺锤体组装检验点(分裂检验点)：纺锤体组装检验点(分裂检验点)是一种进化上高度保守的机制，它保证中期染色体在赤道面上完全排列整齐之前染色单体不会比吃分离，从而保证染色体分配的准确性。四．细胞周期的主要事件：（一）G1期：细胞生长、分裂决定、复制准备1.RNA、蛋白质（与DNA复制有关的酶及与G1期向S期转变相关的蛋白质等）合成和代谢活动旺盛（→细胞的第一生长期）2.分裂决定于：越过限制点（R点）3.DNA含量为2n（二）S期：DNA合成、染色质组装、中心体复制1.DNA复制，2n→4n2.组蛋白、非组蛋白合成3.染色质复制（组装成核小体）4.中心体复制（三）G2期：复制检查、分裂准备1.分裂决定于：越过G2期检验点2.RNA、蛋白质（如微管蛋白、染色质凝集相关蛋白、M期调控蛋白）合成（→细胞的第二生长期）3.DNA含量4n（四）M期：染色体分离、胞质分裂☆DNA的精确分配：有丝分裂/减数分裂五．细胞周期的运行机制：（一）周期性基因表达——细胞周期的原动力：基因表达意味着RNA和蛋白质这两种主要细胞成分的合成。周期性基因表达是细胞周期的宏观组织和调控方式。周期性基因表达受到转录因子回路的调节。（e.g）细胞分裂周期基因（celldivisioncyclegene，cdc基因）（二）细胞周期的引擎——周期性cyclin-Cdk蛋白质磷酸化：cyclin-Cdk复合物：催化靶蛋白(如H1、H3、NHP、lamin、细胞骨架蛋白等)的磷酸化，参与周期的调控。周期蛋白(cyclin)：细胞周期中周期性合成和降解的蛋白质，与Cdk结合，促Cdk对靶蛋白的磷酸化，是复合物的调节亚基。目前从酵母和各类动物中分离出的周期蛋白有30余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。依赖周期蛋白的蛋白激酶(cyclindependentkinase，Cdk)：催化靶蛋白的磷酸化，为复合物的催化亚基。CDK在动物中有7种。①G1期为cyclinD-Cdk4/6和cyclinE-Cdk2；②S期和G2为cyclinA-Cdk2；③M期为cyclinA/B-Cdk1（成熟促进因子MPF）——1）S期开始合成，G2达峰值，M期后期到下一个G1早期被降解2）CDK1激酶活性首先依赖于CycB含量的积累。☆注意：MPF在M期的调节过程RNA聚合酶ⅠⅡⅢ磷酸化后停止转录→前期染色质凝集&核仁解体组蛋白H1磷酸化后相互结合→核小体聚集cyclinA/B-Cdk1核纤层蛋白磷酸化后解聚→核膜破裂&细胞核解体激活后期启动复合体（APC）、促进姐妹染色单体分离、cyclinA/B降解（三）周期性蛋白质泛素化降解——细胞周期的“清道夫”：★主要由APC和SCF引导◇E1：泛素激活酶◇E2：泛素结合酶◇E3：泛素连接酶，包括APC和SCF。——❤APC(后期启动复合物)的活性变化是分裂中期/后期转化的关键问题。❤SCF(蛋白降解复合体)自身则由APC蛋白来调控。①泛素是蛋白质降解标签（被泛素化修饰的蛋白质可被蛋白酶体识别和降解）。泛素化蛋白降解机制是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。②要启动新的细胞周期事件，往往需要清除前一阶段的某些蛋白质，才能避免阶段回复，保证细胞周期运行的方向。因此，周期性蛋白质降解机制被称为细胞周期的“清道夫”。（四）生长因子——细胞周期的外在动力：没有生长因子时，动物细胞不能越过R点，而不能进入S期。生长因子的作用主要是启动细胞信号转导途径，激活CycD的表达。◆生长因子对细胞增殖的影响：1）多数有促进细胞增殖的功能，如表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）；2）少数具有抑制作用，如肿瘤坏死因子（TNF）；3）个别如转化生长因子β(TGF-β)具有双重调节作用，能促进一类细胞的增殖，而抑制另一类细胞。（五）细胞周期运转的阻遏(负调控)：①Cdk抑制蛋白(CKI)：通过与CDK结合来抑制Cyclin-Cdk复合物的装配或其活性，而将细胞阻止在不同的检验点。②周期调控系统组分停止合成▲抑癌基因：其产物主要是细胞周期负调控因子，如CKI，可抑制细胞的生长和分裂。如p53基因。——p53基因：位于人类染色体17p13，表达的p53蛋白是一种核结合蛋白，能阻止DNA损伤或突变的细胞通过R点，从而将细胞阻于G1期，抑制细胞增殖。作用方式之一为p53依赖途径之p53/p21机制：P21主要对G1期Cdk起抑制作用，还直接抑制DNA复制。六．细胞周期与疾病：