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蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化张正光一、前言一、前言一、前言一、前言蛋白质在组织或细胞中一般都是以复蛋白质在组织或细胞中一般都是以复蛋白质在组织或细胞中一般都是以复蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成目前为止，还没有一个单独的或一套现成目前为止，还没有一个单独的或一套现成目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取可能选择一套适当的分离提纯程序来获取可能选择一套适当的分离提纯程序来获取可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。高纯度的制品。高纯度的制品。高纯度的制品。二、蛋白质纯化的总战略考虑二、蛋白质纯化的总战略考虑二、蛋白质纯化的总战略考虑二、蛋白质纯化的总战略考虑1111、蛋白质回收要采用简便易行的方法尽可、蛋白质回收要采用简便易行的方法尽可、蛋白质回收要采用简便易行的方法尽可、蛋白质回收要采用简便易行的方法尽可能多地将目标蛋白从细胞培养上清液、能多地将目标蛋白从细胞培养上清液、能多地将目标蛋白从细胞培养上清液、能多地将目标蛋白从细胞培养上清液、细菌破碎液或组织匀浆中提取出来，收细菌破碎液或组织匀浆中提取出来，收细菌破碎液或组织匀浆中提取出来，收细菌破碎液或组织匀浆中提取出来，收率至少达到率至少达到率至少达到率至少达到90%90%90%90%以上。然后进一步作精纯以上。然后进一步作精纯以上。然后进一步作精纯以上。然后进一步作精纯化，这第一步要求去掉大部分杂蛋白，化，这第一步要求去掉大部分杂蛋白，化，这第一步要求去掉大部分杂蛋白，化，这第一步要求去掉大部分杂蛋白，同时要使样品的体积得到充分浓缩，一同时要使样品的体积得到充分浓缩，一同时要使样品的体积得到充分浓缩，一同时要使样品的体积得到充分浓缩，一般要求要浓缩几十到几百倍，粗提液的般要求要浓缩几十到几百倍，粗提液的般要求要浓缩几十到几百倍，粗提液的般要求要浓缩几十到几百倍，粗提液的体积大大缩小，便于下一步精纯化。而体积大大缩小，便于下一步精纯化。而体积大大缩小，便于下一步精纯化。而体积大大缩小，便于下一步精纯化。而且每一步都要做电泳一判断纯化效果。且每一步都要做电泳一判断纯化效果。且每一步都要做电泳一判断纯化效果。且每一步都要做电泳一判断纯化效果。2222、蛋白质分离纯化技术的选择、蛋白质分离纯化技术的选择、蛋白质分离纯化技术的选择、蛋白质分离纯化技术的选择要尽可能多地了解目标蛋白的结构、要尽可能多地了解目标蛋白的结构、要尽可能多地了解目标蛋白的结构、要尽可能多地了解目标蛋白的结构、氨基酸组成、氨基酸序列，以及氨基酸组成、氨基酸序列，以及氨基酸组成、氨基酸序列，以及氨基酸组成、氨基酸序列，以及蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质的的的的空间空间空间空间结构所决定的物理、化学、生物结构所决定的物理、化学、生物结构所决定的物理、化学、生物结构所决定的物理、化学、生物化学和物理化学性质等信息，根据不同化学和物理化学性质等信息，根据不同化学和物理化学性质等信息，根据不同化学和物理化学性质等信息，根据不同蛋白质之间的性质差异或者改变条件使蛋白质之间的性质差异或者改变条件使蛋白质之间的性质差异或者改变条件使蛋白质之间的性质差异或者改变条件使之具有差异，利用一种或多种性质差之具有差异，利用一种或多种性质差之具有差异，利用一种或多种性质差之具有差异，利用一种或多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择最佳的蛋白质提纯方法。最佳的蛋白质提纯方法。最佳的蛋白质提纯方法。最佳的蛋白质提纯方法。三三三三、色谱分离、色谱分离、色谱分离、色谱分离基本概念基本概念基本概念基本概念1.历史（古希腊的色谱技术）历史（古希腊的色谱技术）历史（古希腊的色谱技术）历史（古希腊的色谱技术）1.1.1.1.现代色谱现代色谱现代色谱现代色谱（（（（Цвет））））色谱、层析、色层色谱、层析、色层色谱、层析、色层色谱、层析、色层(Chromatography)(Chromatography)(Chromatography)(Chromatography)蛋白质分离纯化离不开色谱分离技术。蛋白质分离纯化离不开色谱分离技术。蛋白质分离纯化离不开色谱分离技术。蛋白质分离纯化离不开色谱分离技术。色谱技术包括气相色谱、液相色谱、色谱技术包括气相色谱、液相色谱、色谱技术包括气相色谱、液相色谱、色谱技术包括气相色谱、液相色谱、纸色谱纸色谱纸色谱纸色谱((((纸层析纸层析纸层析纸层析))))、薄层色谱（薄层、薄层色谱（薄层、薄层色谱（薄层、薄层色谱（薄层层析）等。层析）等。层析）等。层析）等。2222、、、、蛋白质分离只能用液相色谱蛋白质分离只能用液相色谱蛋白质分离只能用液相色谱蛋白质分离只能用液相色谱液相色谱柱和色谱分离介质的种类：液相色谱柱和色谱分离介质的种类：液相色谱柱和色谱分离介质的种类：液相色谱柱和色谱分离介质的种类：色谱色谱色谱色谱柱柱柱柱：：：：不同体积的玻璃柱、塑料柱、不同体积的玻璃柱、塑料柱、不同体积的玻璃柱、塑料柱、不同体积的玻璃柱、塑料柱、不锈钢柱、分析柱、制备柱。不锈钢柱、分析柱、制备柱。不锈钢柱、分析柱、制备柱。不锈钢柱、分析柱、制备柱。色谱介质（色谱填料，色谱介质（色谱填料，色谱介质（色谱填料，色谱介质（色谱填料，MediumMediumMediumMedium）：）：）：）：离子交换介质、凝胶色谱介质、离子交换介质、凝胶色谱介质、离子交换介质、凝胶色谱介质、离子交换介质、凝胶色谱介质、疏水相互作用色谱介质、亲和色疏水相互作用色谱介质、亲和色疏水相互作用色谱介质、亲和色疏水相互作用色谱介质、亲和色谱介质、金属谱介质、金属谱介质、金属谱介质、金属螯螯螯螯和色谱介质等。和色谱介质等。和色谱介质等。和色谱介质等。4444、、、、液相液相液相液相色谱色谱色谱色谱（（（（LiquidChromatographyLiquidChromatographyLiquidChromatographyLiquidChromatography））））液液色谱：液液色谱：液液色谱：液液色谱：固定相和流动相都是液体固定相和流动相都是液体固定相和流动相都是液体固定相和流动相都是液体原理：原理：原理：原理：不同不同不同不同溶质在两相中的分配系数不同溶质在两相中的分配系数不同溶质在两相中的分配系数不同溶质在两相中的分配系数不同。。。。正相色谱：正相色谱：正相色谱：正相色谱：固定相固定相固定相固定相功能基为功能基为功能基为功能基为极性极性极性极性基团基团基团基团，，，，如硅胶如硅胶如硅胶如硅胶硅藻土、氧化铝、多孔硅胶键合的氨基柱、氰硅藻土、氧化铝、多孔硅胶键合的氨基柱、氰硅藻土、氧化铝、多孔硅胶键合的氨基柱、氰硅藻土、氧化铝、多孔硅胶键合的氨基柱、氰基柱等。基柱等。基柱等。基柱等。流动相：流动相：流动相：流动相：正己烷、四氢呋喃正己烷、四氢呋喃正己烷、四氢呋喃正己烷、四氢呋喃++++氯仿氯仿氯仿氯仿。。。。反相色谱：反相色谱：反相色谱：反相色谱：固定相固定相固定相固定相非极性基团（非极性基团（非极性基团（非极性基团（烷基烷基烷基烷基，，，，C-18C-18C-18C-18、、、、C-8C-8C-8C-8、、、、C-4C-4C-4C-4等。等。等。等。用于分离强极性或弱极性用于分离强极性或弱极性用于分离强极性或弱极性用于分离强极性或弱极性化合物化合物化合物化合物如蛋白质、多肽、核酸以及其它极性化合物等。如蛋白质、多肽、核酸以及其它极性化合物等。如蛋白质、多肽、核酸以及其它极性化合物等。如蛋白质、多肽、核酸以及其它极性化合物等。流动相流动相流动相流动相：：：：乙腈乙腈乙腈乙腈----水或甲醇水或甲醇水或甲醇水或甲醇----水，乙醇水，乙醇水，乙醇水，乙醇----水等。水等。水等。水等。5.5.5.5.离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱（（（（IonExchangeChromatography,IECIonExchangeChromatography,IECIonExchangeChromatography,IECIonExchangeChromatography,IEC））））原理：原理：原理：原理：离子交换介质功能基上可以电离的离子与流动离子交换介质功能基上可以电离的离子与流动离子交换介质功能基上可以电离的离子与流动离子交换介质功能基上可以电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质相中具有相同电荷的溶质相中具有相同电荷的溶质相中具有相同电荷的溶质分分分分子进行可逆交换子进行可逆交换子进行可逆交换子进行可逆交换,,,,分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。1)1)1)1)、、、、阳离子交换色谱阳离子交换色谱阳离子交换色谱阳离子交换色谱：：：：SPSPSPSP、、、、MSMSMSMS、、、、CMCMCMCM、、、、PEPEPEPE等。等。等。等。缓冲液：磷酸缓冲液、乙酸缓冲液：磷酸缓冲液、乙酸缓冲液：磷酸缓冲液、乙酸缓冲液：磷酸缓冲液、乙酸----乙酸钠、磺酸型乙酸钠、磺酸型乙酸钠、磺酸型乙酸钠、磺酸型缓冲液（缓冲液（缓冲液（缓冲液（MESMESMESMES、、、、HEPAS)HEPAS)HEPAS)HEPAS)等。等。等。等。2)2)2)2)、、、、阴离子交换色谱阴离子交换色谱阴离子交换色谱阴离子交换色谱：：：：DEAEDEAEDEAEDEAE、、、、QAEQAEQAEQAE、、、、QQQQ等。等。等。等。缓冲液：缓冲液：缓冲液：缓冲液：Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HCl，双，双，双，双Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HCl,,,,乙醇胺等。乙醇胺等。乙醇胺等。乙醇胺等。6.6.6.6.凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱（（（（GelChromatography)GelChromatography)GelChromatography)GelChromatography)1)1)1)1)、原理：、原理：、原理：、原理：按照分子量（体积）大小进行分离按照分子量（体积）大小进行分离按照分子量（体积）大小进行分离按照分子量（体积）大小进行分离凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱(GelpermeationChromatography)(GelpermeationChromatography)(GelpermeationChromatography)(GelpermeationChromatography)凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱(Gelfiltrationchromatography)(Gelfiltrationchromatography)(Gelfiltrationchromatography)(Gelfiltrationchromatography)体积排除色谱体积排除色谱体积排除色谱体积排除色谱(Sizeexclusion(Size