发育生物学教案-2015年

1实验一秀丽隐杆线虫的培养及其发育过程的观察一、实验目的1.理解线虫作为模式生物的优势以及在相关研究领域的应用；2.掌握线虫的基本培养技术，观察并且区分两种线虫个体发育过程的异同；3.理解线虫RNA干扰技术的基本原理，并学会使用该方法对目的基因进行干扰。二、实验原理秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegan）属于线虫动物门（Nematoda）隐杆线虫属（Caenorhabditis）秀丽隐杆线虫种（C.elegans），根据命名法则中的二名法命名为Caenorhabditiselegans。上世纪六七十年代分子遗传学的奠基人之一SydneyBrenner将线虫作为分子生物学和发育生物学研究的模式生物。C.elegans为蠕虫状，长度约1mm，因其个体结构简单、体细胞数目恒定，特定细胞位置固定，生活史短、遗传背景清楚、基因组测序已经完成等，在遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类遗传性疾病、病原体与生物机体的相互作用、药物筛选、动物的应急反应、环境生物学和信号传导等领域得到广泛应用。如细胞凋亡现象及其机理以及RNA干扰技术最早都是在线虫中被揭示的。C.elegans的基本结构以及生活史C.elegans有雌雄同体（XX）和雄虫(XO)两种性别，在自然条件下，成虫大多为雌雄同体，雄虫的个体数只占大约千分之一。其基本的结构包括口、咽、肠、性腺以及胶原蛋白角质层，雌雄同体有两个卵巢、输卵管、储精囊，及单一一个子宫（图1，2），雄性有个单叶的性腺、输精管及一个特化为交配用的尾部（图3，4）。C.elegans是唯一一个身体中的所有细胞能被逐个盘点并各归其类的生物。其幼虫含有556个体细胞和2个原始生殖细胞，而它的成虫则根据性别不同具有不同的细胞数。最常见的雌雄同体成虫在发育期间，共产生1090个细胞，其中131个在特定时期凋亡，因此，其成熟后含有959个体细胞和2000个生殖细胞，而较少见的雄性成虫则只有1031个体细胞和1000个生殖细胞。C.elegans有五对常染色体和一对性染色体，是一个染色体数很少的二倍体。图1雌雄同体线虫解剖示意图2图2雌雄同体线虫A．DIC（微分干涉显微镜）拍摄的图；B.雌雄同体线虫解剖示意图图3雄虫A.雄虫解剖示意图；B.DIC（微分干涉显微镜）拍摄的图；C.性腺放大图；D.成虫尾巴放大图；E.L3L4时期雄虫尾巴图（上面是L4，下面是L3）图4：电镜下的雄虫图5雄虫和雌雄同体线虫交配C.elegans的生活史包括胚胎期、幼虫期（L1-L4）、成虫期三个阶段（如图6）。一个雌雄同体线虫一生约可以产300个卵，卵经过L1、L2、L3、L44个幼虫时期，进入成虫期，如果外部条件比较恶劣，比如：拥挤、缺乏食物等，线虫会进入一个特殊的L3时期——dauer时期来抵抗外部的不良环境。C.elegans在实验室20-22℃的条件下，约3.5天长成成虫，可存活两到三周。线虫可以自体受精，当卵母细胞经过贮精囊时受精，也可以接受雄虫的精子进行异体受精（图5）。3图622℃下秀丽隐杆线虫的生命周期4（二）线虫RNAi技术：RNAi（RNA-mediatedinterference）技术是指与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达（图7）。RNAi技术已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。图7RNAi原理示意图1、长的双链RNA（Longdouble-strandedRNAs，dsRNAs;typically200nt）被引入细胞；2、宿主细胞对这些dsRNAs产生反应，核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23bp），即siRNA；3、siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)；4、RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位的两端切割mRNA，使目标mRNA降解；1998年，Fire建立了线虫RNA干扰技术，由于线虫RNAi操作简单、特异性高、干扰效果持久，并且也是一种最简单有效的抑制特定基因表达的方法，已经成为反向遗传学研究的一个有力的工具。线虫RNAi干扰的方法主要有三种：一、直接显微注射dsRNA；二、将线虫培养在含有dsRNA的液体培养基中；三、喂食能够表达dsRNA的大肠杆菌。其中第三种方法由于适用于大规模的操作，简单经济等原因，使用比较普遍。本实验采用喂食能够表达dsRNA大肠杆菌的方法，来干扰线虫Chc-1以及DAF-16两个基因的表达。Chc-1参与卵黄的内吞作用，当RNAi使其表达量下降后可导致线虫的胚胎死亡，线虫发育阻滞在幼虫期。在做RNAi干扰实验时，通常用这个基因作为阳性对照。5Daf-16是FOXO家族的成员，该基因主要是通过其转录因子的功能调控一些基因的表达来参与细胞功能。研究表明，DAF-16基因同寿命、免疫力密切相关，是一种寿命调控因子。实验用的大肠杆菌是OP50以及HT115（DE3）。HT115（DE3）菌株是RNAseIII（dsRNA特异性降解酶）缺陷型，并且可以通过IPTG诱导T7RNA聚合酶的大量表达。实验用的质粒有三种：L4440空载质粒，Chc-1干扰质粒（多克隆位点插入Chc-1基因的L4440质粒），Daf-16干扰质粒（多克隆位点插入Daf-16基因的L4440质粒）。图8L4440质粒结构图实验用的C.elegans有两种，野生型N2以及突变型TJ356。TJ356线虫的基因组中整合了DAF-16::GFP以及roller基因。DAF-16::GFP主要定位在肌肉细胞，肠道细胞和神经细胞，这些部位有绿色荧光产生，而roller基因可以导致线虫不能顺利呈S型游动，而是在原地转圈，所以在培养基上可看见一个一个圆圈。三、实验器材（一）实验用品恒温生化培养箱、解剖显微镜、超净工作台、6cm培养皿、挑针、摇床、10ml离心管以及管架、1.5ml离心管以及管架、250ml锥形瓶、酒精灯、75%酒精棉球（二）实验材料野生型N2线虫、TJ356线虫、E.coliOP50以及HT115、LB固体培养基、LB液6体培养基、NGM培养基等。四、实验步骤1、线虫培养板的准备：（1）配置NGM(NematodeGrowthMedium)线虫基本培养基A.配置以下试剂1MKPO4缓冲液：108.3gKH2PO4、35.6gK2HPO4加水至1升（高压灭菌）1MMgSO4（高压灭菌）1MCaCl2（高压灭菌）5mg/ml胆固醇（用无水乙醇配置，配完后，过滤，4℃保存）B.称取3gNaCl、2.5g蛋白胨、20gAgar到锥形瓶中，加入975mlH2O，高压灭菌，121℃20minC.待培养基冷却至55℃时，加入25ml1MKPO4缓冲液、1ml1MCaCl2,1ml1MMgSO4、1ml5mg/ml胆固醇、（4ml1MIPTG、1ml100mg/ml氨苄）（用于干扰实验），混匀。D.将混匀的培养基倒入线虫培养皿中，约2/3培养皿高度。室温放置过夜。（2）线虫食物的准备：A.配置LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5gNaCl到锥形瓶中，加入1LH2O，调PH值到7.0，高压灭菌B.吸取灭菌后的5mlLB液体培养基到10ml已灭菌的管中，挑取op50或HT115单克隆到液体LB中，37℃振荡过夜(10-15h)。菌液可4℃保存2周。（3）每个NGM平板中滴入200μl的菌液，室温放置过夜，即可用于线虫的培养。2、线虫的观察：每个小组在解剖显微镜下，对观察用线虫（主要是N2）按照下列提纲进行观察：认识线虫的各主要组织器官：头部、尾部、咽、肠、子宫；区别雌雄同体以及雄虫；观察线虫的运动方式；观察线虫的进食、产卵（线虫约20分钟产一次卵，每次可连续产5-10个卵）等行为；区分各个发育时期的线虫。3、挑虫、培养：(1)将铂金丝做的笔在酒精灯上烧红后，在线虫培养基上轻划几下，即可用于挑虫；(2)解剖显微镜下找到合适的成虫，用“笔”将它轻轻挑起，迅速在解剖显微镜下将之放到新的平板上，共挑取3-5只线虫；(3)将培养皿做好标记，放到20℃生化培养箱中培养；7(4)产卵3小时后，显微镜下可以看见培养皿上有椭圆颗粒状的线虫卵（胚胎），此时，可以将成虫挑走。产卵当天计作day0。(5)Day1(次日)上午，胚胎发育成幼虫L1时期。(6)Day2下午线虫发育到L4时期，显微镜下可看见线虫的腹部有白色的点。(7)Day3上午线虫开始产卵，一个生活周期结束。4、线虫RNA干扰实验(1)含空载质粒菌作为阴性对照组、含chc-1干扰质粒菌作为阳性对照组、含daf-16干扰质粒菌作为实验组，每组各准备一个平板（三块平板有何不同？）。(2)每只板上挑取3-5只含有GFP的线虫（TJ356），产卵3小时。计做day0。(3)day3观察各个平皿中线虫形态的不同。(4)挑取day3期各个平皿中的线虫，制成Pad，在荧光显微镜下观察，拍摄各个实验组的照片。五、实验注意事项1、挑虫要多加练习，不要急于做实验。2、有些观察项目需要对同一个虫子进行连续观察，请耐心点。3、在操作过程中，注意不要将培养基戳破，防止线虫钻进培养基内不方便观察。4、操作过程中尽量少说话，防止污染线虫培养基。5、如果在超净台外观察线虫，尽量不要打开培养皿的盖子。6、线虫容易失水死亡，尽量缩短线虫离开培养基的时间。六、思考题1、本实验是哪种线虫的什么基因被什么干扰之后不表达了？为什么被干扰基因会不表达？这种干扰效果可以遗传吗？可以持续很长时间吗？2、HT115（DE3）大肠杆菌和L4440质粒是线虫RNA干扰实验中最常用到的实验材料，请问它们的配合对线虫RNA干扰实验有何好处？8实验二斑马鱼的饲养及胚胎发育过程的观察一、实验目的1.学习并掌握实验室饲养斑马鱼的方法。2.掌握斑马鱼胚胎发育过程的主要特点。二、实验原理斑马鱼（Deniorerio）属鲤科短担尼鱼属，是一种常见的热带鱼，体形纤细呈梭形，体侧有水平分布均匀的条纹，成鱼体长3～4cm，最长可达6.5cm，寿命为2～3年。雄鱼鱼体较修长，腹部偏黄；雌鱼鱼体较肥大，腹部偏白。上世纪70年代初美国俄勒冈大学著名遗传学家和发育生物学家GeorgeStreisinger教授首次提出将斑马鱼作为模式生物。目前，斑马鱼已成为重大疾病的分子发生机制、疾病模型构建及药物筛选等研究领域中重要的研究材料。斑马鱼作为研究高等脊椎动物的发育过程及其分子发育机制的重要材料主要是由于其具有：①个体小，养殖花费少，可大规模繁殖；②体外受精，产卵多，体外发育；③胚胎发育同步（25～31℃发育正常），胚胎透明；④成体长3～4cm，孵出后约3个月可达性成熟；⑤有丰富的品系资源；⑥染色体数为50，基因组序列已经全面测出等优点。上为雌鱼，下为雄鱼斑马鱼已经具备独立的脏器且与高等动物的相应器官在很多地方具有较大的相似性，早期胚胎是通过被动扩散的方式进行呼吸作用而存活不借助于血液循环系统维持生存，而且在任何基因缺失的条件下都不会死亡，因此较小鼠等模式动物有一定优势。斑马鱼胚胎发育主要经历受精卵（0～0.75hpf）、卵裂（0.75hpf～2.25hpf）、囊胚（2.25hpf～5.25hpf）、原肠胚（5.25hpf～10.33hpf）、分节期（10.33hpf～24hpf）、咽裂期（24hpf～48hpf）、孵化期（48hpf～972hpf）等阶段。10三、实验器材（一）实验用品：恒温培养箱、体视显微镜、培养皿、斑马鱼养殖系统、丰年虫孵化器、粉碎机(二）实验材料：野生型斑马鱼、丰年虫卵、冰冻红虫、片状鱼食、培养皿、凹槽载玻