实验一--花粉收集

实验一花粉收集、贮藏及花粉生活力测定一、实验目的1.掌握鲜花粉收集、储藏的方法及原理。2.观察花粉在人工配制的培养基上的萌发情况，认识花粉萌发形成花粉管的外形和伸长过程，为理解植物的生殖过程奠定基础。二、实验原理花期不遇，给杂交工作造成困难，有的树木和园林植物可通过延长花期解决，有的不得不进行花粉储藏，花粉贮藏对某些园林植物杂交育种具有重要的意义。通过花粉贮藏，它可以使一些迟开花的园林植物和早开花的园林植物进行杂交，或到较远的地方给母本授粉，花粉的贮藏与运输可以打破杂交育种中双亲时间上和空间上的隔离，扩大育种的范围。花粉在贮藏期间的稳定性，与花粉壁外层（外壁）的性质和贮藏期间花粉原生质的代谢有关。在贮藏期间代谢调较少可溶性糖类和有机酸的花粉能够在较长期间保持其活力。花粉贮藏的原理在于创造一定的条件，使花粉降低代谢强度，延长花粉的寿命。花粉寿命的长短，因植物种类不同而异。在自然条件下，大多数植物的花粉从花药散出后只能存活几小时，几天或几个星期。如一般木本植物花粉寿命很长，如在干燥凉爽的条件下，柑橘花粉能存活40～50d，椴树45d，苹果10～70d，樱桃30～100d，麻栎一年，叶培忠教授试验发现杉木的花粉可存活17年之久；而在草本植物中，如棉属花粉采下后24h存活只有65％，超过24h很少存活；多数禾本科植物的存活时间不超过一天，如玉米1～2d，水稻花粉在田间条件下3min就有50％丧失生活力，5min后几乎全部死亡，是寿命最短的例子。一般在自然条件下自花授粉植物花粉寿命比常异花、异花授粉植物为短。花粉的类型和生活力也表现了相关性，通常三胞花粉的寿命要比二胞花粉短，如水稻等禾本科植物为三胞花粉，寿命都是比较短的。花粉寿命的长短除了上述因种遗传性的差异以外，还与温度、湿度有密切的关系。通常高温高湿下花粉呼吸旺盛，会很快失去生命力，但在极干燥的条件下，花粉失去水分，也不利于保存。据亚达姆斯试验，苹果花粉在干燥状态下，可保存3个月；如放在2～8℃，湿度80％的条件下，经过5个星期即失去生活力。维霍夫试验中，丁香的花粉贮藏在干燥器中，15d以后发芽率降到50％；至20d时，仅有个别花粉发芽；到30d时，即全部死亡。因此，暂时不用的花粉，应立即在适宜的条件下贮藏，妥善保存。为保持花粉生活力则人为采取减低其代谢强度，保持其纯洁性，将其贮存于低温、干燥、黑暗，并较为稳定的环境条件下，以保持其活力。近年来，在贮藏花粉方面利用超低温（-192℃的液态空气或-196℃的液氮）、真空或降低氧分压以及快速冷冻干燥等方法，延长花粉生活力取得良好的效果及应用。了解花粉的生活力对于农林生产和育种工作具有重要意义。在生产和杂交工作中需要进行的人工辅助授粉的杂交授粉，都需要收集和贮藏具有生活力的花粉，花粉的生活力除受植物本身的遗传决定外，同时受环境影响。不同来源的花粉生活力高低存在很大差异，花粉生活力的大小是保证杂交成功的关健。在有性杂交育种中，常因父母本花期的不同，作为父本的花粉必须经过贮藏直到母本植株开花时在植株开花时在用于授粉；为了避免杂交工作失误，在使用远地寄来的花粉或一段时间储藏的花粉之前，必须对花粉生命力进行鉴定，以便对杂交成果进行分析与研究。通常花粉的形态、花粉中酶的活性以及积累淀粉（淀粉质花粉）的多少与花粉生活力密切相关，因此可以利用花粉的形态观察，过氧化物酶、脱氢酶的活性高低，淀粉的含量以及在人工培养基上花粉管萌发的情况作为确定花粉生活力高低的标准。三、实验材料、主要试剂及仪器（一）各种园林植物花粉如榆叶梅百合、牡丹、凤仙花、柳树、菊花、月季、紫茉莉等植物的花粉（二）主要仪器载玻片、盖玻片、凹玻片、解剖针、毛笔、棉球、干燥器、硫酸纸级硫酸纸袋、曲别针、小指形管、标签、标记笔、显微镜、脱脂棉、花粉筛、冰箱、显微镜、恒温温箱、瓷盘、镊子、培养皿、玻璃棒、玻璃铅笔、凡士林（三）主要试剂硫酸H2SO4（相对密度1.45）、无水氯化钙、硅胶、碘－碘化钾、氯化三苯基四氮唑、联苯胺、-萘酚、Na2HPO4·2H2O、KH2PO4、蔗糖或葡萄糖溶液、H3BO3、Ca（NO3）2、MgSO4、KNO3、酒精、碳酸钠、过氧化氢四、实验方法与步骤（一）收集花粉选择健壮的植株上正常的花朵，在开花前一天套硫酸纸袋，下口用曲别针别好以免混入其他花粉，第二天花药开裂后收集花粉；或采集开花前一天的花粉，第二天进行必要的加温处理，使花药开裂后收集花粉；或采集开花前一天的花蕾，第二天进行必要的加温处理，使花药开裂后搜集花粉。注意一定要采集花药开裂前后的新鲜花粉，对不成熟的幼嫩花药的花粉，成熟过头的花粉被雨露粘湿的花粉，有疑问的花粉基杂质要除去。（二）干燥及贮藏花粉采集后置于清洁的环境，以免菌类侵入引起发霉影响生命力，并及时干燥，可放在散光下晾干、阴干或放入盛有CaCl2（H2SO4、硅胶、醋酸钾饱和液、NaOH等）的干燥器中干燥，一般以花粉由相互粘结至极易分散象水一样不粘玻璃壁为度，用花粉筛筛去杂质，根据使用的次数将其分装于数个指形管中，避免因启封而使温度、湿度剧变造成花粉生活力锐减。一般以1/5或更少为宜，管口用脱脂棉塞好，活用双层的干净纱布扎好，有利于气体交换和过滤气体，贴好标签，表明植物品种名称、采集日期、地点、贮藏条件（湿、温条件）即统一编号。然后放入无水氯化钙或不同浓度的H2SO4控制的一定湿度的干燥器中，最后把干燥器置于0～2℃或0℃以下的冰箱中贮存。同时设对照，在室内自然温度、湿度及阳光条件下，个一定时间进行花粉生活力测定，比较其差异性。（三）花粉生活力测定鉴定花粉生活力的方法有很多，概括起来不外下列几种：一是将待测花粉直接授粉，最后计算结实数和结籽数；二是将花粉授到柱头上，隔一定时间切下柱头，在显微镜下观察花粉萌发情况，测定萌发率；三是形态观察；四是染色观察；五是在人工培养基上播种花粉，观察萌发率。以后三种为主介绍花粉生活力测定的具体方法。1.形态观察法一般把具有品种典型性的花粉（指具有该品种花粉粒的大小、形态色泽等）作为具有生活力的花粉，把小型的、皱瘪的、畸形的作为无生活力的花粉。形态观察的具体方法是：首先将花粉置于载玻片上，在显微镜下查看5个视野，要求被检查的花粉粒总数达100粒以上，计算正常花粉粒占总数的比率。此法简便易行，但准确性差，通常只用于测定新鲜花粉的生活力。2.染色观察法（1）碘－碘化钾染色法。先称取0.3g碘和1.3g碘化钾溶于100ml的蒸馏水中，即成碘－碘化钾溶液。取少量花粉振播到用棉球擦净的普通载玻片上，然后加水一滴，使花粉散开，再加一滴碘－碘化钾溶液，盖上盖玻片，置于显微镜下观察不同的5个视野，凡花粉粒被染成蓝色的表示具有生活力，呈黄褐色为缺少生活力的花粉（遇碘变蓝是淀粉的特性）。（2）氯化三苯基四氮唑（TTC）法。凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用中都有氧化还原作用，而无生活力的花粉则无此反应，因此当TTC渗入有生活力的花粉时其脱氢酶在催化去氢过程中与TTC结合，是污水的TTC变成TTF而成红色。磷酸盐缓冲液的配置：在100ml的蒸馏水中溶解0.832g的Na2HPO4·2H2O和0.273g的KH2PO4，调整pH值为7.17。TTC溶液配置：取0.02～0.05g的TTC溶解于10ml磷酸缓冲液中，放于棕色瓶中，置于暗处。取少量花粉于凹玻片的凹槽内或直接放于普通载玻片上，滴入0.5％TTC溶液一两滴，用镊子搅拌均匀，盖上盖玻片，将此片置于35～40℃下15～20min，在显微镜下观察不同的5个视野，反被染成红色的均为有生活力的花粉。（3）-萘酚法①配制药液A.将0.20g联苯胺溶于100ml的50％的乙醇中，盛入棕色瓶中，放暗处备用。B.0.15克-萘酚溶于100ml的乙醇中，盛入棕色瓶中，放暗处备用。C.0.25克碳酸钠溶于100ml蒸馏水中，盛入白色瓶中备用。D.将以上三种溶液等量混合，即成“甲液”，盛如棕色瓶中。E.将3%过氧化氢，临用前用蒸馏水稀释成0.3%溶液，即成“乙液”，随配随用。②制片取花粉少许，撒入凹型载玻片的凹点内，滴入“甲液”，片刻后在滴入“乙液”，3～5min后，在显微镜下观察不同的5个视野。凡有生活力的花粉为红色或玫瑰红色。黄色的（不着色的），为无生活力的花粉。3.发芽实验法此法受花粉萌发的培养基限制。若有适宜的培养基能精确测定出具有生活力并能够萌发的花粉粒的个数，还能看到花粉粒发芽的真实情况。（1）悬滴液发芽法把供试花粉播种在一定浓度的培养液液面上，使其花粉真实地发芽，以测定生活力高低的一种方法。培养液一般都是用蔗糖或葡萄糖溶液，浓度因物种而不同，差别很大。糖液浓度高低是为了调节培养基的渗透压，防止供试的花粉在溶液中发生破裂。适合多数园林植物花粉的发芽，通用培养基配方如下：蔗糖10％加H3BO3100mg/L，Ca（NO3）22300mg/L，MgSO4200mg/L，KNO3100mg/L，可配成母液，用时稀释，母液放在冰箱中保存。具体操作方法：配制10％蔗糖溶液，滴一滴于凹玻片上，取少量花粉置于滴液中，用大头针搅拌均匀，然后将凹玻片放在培养皿加盖放到20-25℃温箱中。加盖2h后花粉即开始萌发，24h后在显微镜下检查发芽花粉的百分率。不同物种的花粉发芽所需的时间不同，如牡丹花粉用15％蔗糖溶液在室温条件下，接种后一小时即可观察。花粉发芽检查在低倍镜下进行，花粉的长度为花粉粒直径2倍以上才算发芽，一倍以上者算萌芽。（2）培养基发芽法①培养基的制备：在250ml的烧杯中加入90ml蒸馏水，再加入1g的琼脂，在酒精灯上加热，使之完全溶解，然后加入定量蔗糖，制成不同浓度（5%、10%、15%、20%）的蔗糖琼脂培养基（分组加，每组制成一个浓度），为了防止水分蒸发，配制加热的烧杯应加盖。先把水在酒精灯或电炉上加热煮开，倒入琼脂，使之融化，然后倒入蔗糖，用玻璃棒不断搅拌，呈透明状即可。为保持培养的浓度，可在烧杯上液面处贴上纸条或用玻璃铅笔沿液面划线标记，当液面在熬制过程中因水分蒸发下降时应及时添加蒸馏水，以保持液面的稳定和培养基的标准浓度，并将熬制好的培养基溶液连同烧杯放入盛有35℃热水的容器中，防止冷却凝固，以备随后使用，即配成5%浓度的培养基。同法配成10%、15%、20%浓度的培养基。②用品消毒：发芽实验时所用的载玻片、凹玻片、镊子等都要在消毒柜中消毒或在100℃条件下煮沸20min，冷却后取出用酒精棉球擦干放在大培养皿中备用，经过消毒过的载玻片使用时要尽量减少和手指接触的面积，以减少污染。③花粉的播种与检查：用玻璃棒蘸取培养基溶液，立即滴一滴于盖玻片的中央（直径1.5-2.0mm），使成为一表面完整的球面（球面越薄越好，否则透光性差，影响在显微镜下观察），当凝固后再进行花粉的播种。播种花粉时，用经过酒精消毒过的发丝蘸取花粉（若所用花粉为陈花粉或过于干燥的花粉时，可在播种前取出一部分在湿气大的培养皿中密闭15-30min后在行播种），轻轻震动（风媒花）或涂抹（虫媒花）在培养基表面。一要注意发丝不能过重地接触培养基表面，避免破坏培养基的表面；二是要注意花粉的分布要松散、均匀，不能密集成堆，；三要注意适宜的播种数量。经验证明，花粉太稀，影响发芽，播种太稠也影响发芽，一般情况下，一个显微镜视野以分布20-50粒花粉为宜。播好后将盖玻片翻转，置于载玻片上的小玻璃环上，小玻璃环上下涂上凡士林，环内加1第水用于保湿。湿室密封后，应在载玻片上用玻璃铅笔标号，并进行记录，记录内容包括花粉种类、培养基的糖液浓度、采粉时间，播种时间、湿室中滴水的多少。然后全组集中放在一个大的瓷盘中，用纱布覆盖后加盖，放于15-25℃的温箱内24h后进行检查。如果时间允许，最好播后每隔2-3h检查一次，直至花粉粒发芽数不再增加为止，记载花粉发芽数，以明确不同花粉的发芽的速度和发芽进程。牡丹花粉接种后1h即可观察。花粉发芽检查在低倍镜下进行，花粉的长度为花粉粒直径2倍以上算发芽，一倍以上者算萌芽。每片应观察5个视野花粉数不少于100粒以上，计算发芽率，此法每人做3片，选发芽情况最好的一片进行发芽情况的检查。五、思考题1.详