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重组羧肽酶B的性质关键词：羧肽酶B,carboxypeptidaseB,碱性峰来源：雅心生物羧肽酶B(EC3.4.17.2)专一用于蛋白质C-末端碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）的水解；又称为肽酰-L-赖氨酸（L-精氨酸）水解酶；精蛋白酶。分子量为35kD，等电点为6.0，最适pH为7-9。羧肽酶B是抗体碱性峰检测的特异酶，通过比较酶切前和酶切后的图谱来计算抗体碱性变体的比例，对于抗体的发酵工艺和纯化工艺稳定性的控制都具有重要的意义。而在抗体碱性峰的检测中，没有完全统一的标准，如酶解缓冲液酶的用量，酶解时的温度和时间等。而这些与酶的性质密切相关。可以选择的羧肽酶B有两种，一种是动物胰腺提取的羧肽酶B，一种是基因工程的重组羧肽酶B，前者由于胰腺中含有各种蛋白酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶等，常常不能彻底去除，在酶切时会有非特异的酶切杂峰出现，影响结果判断。后者为基因工程生产的，成分单一，无杂酶，比活高，应用上更有优势。羧肽酶B的结构天然存在的羧肽酶B是由前羧肽酶原B（preprocarboxypeptidaseB，preproCPB）经酶解产生，后者N-末端包含108个氨基酸（其中13个氨基酸为信号肽序列，95个氨基酸组成前导肽部分）的多肽片段与CPB相连。前羧肽酶原B在转运到内质网的过程中，信号肽被切掉，得到无酶活性的羧肽酶原B（procarboxypeptiedaseB,proCPB）并从细胞中分泌出来，最终在小肠中经胰蛋白酶在Arg-95处酶解，成为具蛋白酶活性的CPB。proCPB的分子量为46kD，由401个氨基酸组成；CPB分子量为35kD，由306个氨基酸组成（如图1）。在CPB中，前体的活化主要依赖胰蛋白酶在Arg95位的切割，半球形前导肽被切割后，它既不会抑制酶体，也不再与之结合，这使得酶体能迅速发挥功能，并对前导肽C-端的Arg进行切割。图1羧肽酶原B的三维结构及其激活部位示意图（上面暗红色部分代表前肽，下面蓝色部分代表羧肽酶B，箭头所指为胰蛋白酶酶切激活位点）羧肽酶B的性质取重组羧肽酶B冻干粉，纯度见图2。研究了重组羧肽酶B的最适pH，最适温度，pH稳定性及温度稳定性，对于CPB的使用起到指导作用。同时做了溶液的反复冻融稳定性，对于CPB酶液的储存和使用起到指导作用。图2纯化后重组羧肽酶B的电泳分析1、羧肽酶B的pH稳定性将纯的重组羧肽酶B用纯水溶解为10mg/ml，之后用以下缓冲液稀释使酶液的终浓度为1mg/mL，pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0，25℃孵育12h后测活。结果见图3（左）。2、羧肽酶B的最适pH测定rCPB纯酶液浓度为1mg/mL,在不同pH条件下的催化速率，底物浓度为0.1mM/L，pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、7.65、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0，pH3.0-5.0用50mMNaAc-HAc缓冲液配制，pH6.0-7.0用50mMKPB磷酸盐缓冲液配制，pH7.5-8.5用50mMTris-HCl缓冲液配制，pH9.0-12.0用50mMGly-NaOH缓冲液配制。结果见图3（右）。图3rCPB酶液的pH稳定性（左）和最适反应pH（右）CPB在pH7.0-9.0缓冲液中稳定，25℃孵育12h无活性损失；最适pH表明，在pH7.6活性最大，在pH7.5-pH8.5活性均可以。在pH≤7和pH≥10时，基本无活性。3、羧肽酶B的温度稳定性将rCPB酶液配成浓度为1mg/mL，置于4℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃条件下，每个温度三个平行，时间定为15min、30min、1h、2h、4h、8h、20h分别取样测定其活性，以初始时酶活定为100%，以残余酶活百分比表示测定结果。4、羧肽酶B的最适催化温度在不同温度下恒温水浴测活底物，使底物的温度分别为4℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，取适量rCPB纯酶液，测定活力。以254nm吸光值OD254为纵坐标，时间为横坐标，结果表示见图4（右）。图4rCPB酶液的温度稳定性（左）和最适催化温度（右）CPB在40℃以下保温10h，均活性稳定。最适催化温度显示，在3min内，40℃以下均可保持良好的线性，其中，以25℃为最佳。5、羧肽酶B酶液的反复冻融稳定性将rCPB酶液反复冻融，测定每次冻融后的酶活，计算活力保留率，得到同一管rCPB反复冻融10次后的活力稳定性（如图5）。图5rCPB酶液的反复冻融稳定性结果表明重组羧肽酶B反复冻融稳定性好。经过10次的反复冻融，几无活性损失。