猪链球菌2型MRP与EPF基因串联表达蛋白及其免疫保护

中国农业科学2005,38(6):1264-1269ScientiaAgriculturaSinica收稿日期：2004-09-29基金项目：国家“973”项目（G1999011906）和江苏省(三药)科技攻关项目（BE20040620）资助作者简介：李明(1979-),男,湖北宜昌人,硕士研究生,主要从事兽医微生物与免疫学研究。E-mail:[e-mail]。何孔旺为通讯作者,Tel:[phone];E-mail:[e-mail]猪链球菌2型MRP与EPF基因串联表达蛋白及其免疫保护作用李明1,2，何孔旺2，陆承平1（1南京农业大学/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，南京210095；2江苏省农业科学院兽医研究所/农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室，南京210014）摘要：根据猪链球菌2型（Streptococcussuistype2,SS2）溶菌酶释放蛋白(muramidase-releasedprotein,MRP)和胞外蛋白因子（extracellularproteinfactor，EPF）的基因序列，各设计合成一对引物，以猪链球菌2型江苏分离株SS2-1的基因组为模板，扩增mrp基因1801~2513位序列和epf基因1783~2563位序列，分别构建原核表达载体pET32a-mrp、pET32a-epf，确定诱导表达的两种蛋白都具有免疫原性后，提取阳性克隆质粒各自进行双酶切并纯化，通过PCR串联两片段,将目的片段定向克隆到表达载体pET-32a中，重组质粒转化入大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达分子量约为74kD的融合蛋白。用制备的两种抗血清与纯化融合蛋白进行免疫转印,结果显示融合蛋白分别具有MRP与EPF的中和表位。用融合蛋白MRP-EPF免疫新西兰兔,以最小致死量猪链球菌强毒株SS2-1攻击,兔的存活率达50%(2/4),存活率明显高于单个表达产物。证实串联表达的融合蛋白为重要的保护性抗原。关键词：猪链球菌2型；溶菌酶释放蛋白；胞外蛋白因子；融合表达；中和表位CloningandExpressionofaFusionProteinofMuramidase-ReleasedProteinandExtracellularProteinFactorofStreptococcussuisType2andItsProtectionLIMing，HEKong-wang，LUCheng-ping(1KeyLabAnimalDiseaseDiagnosticandImmunology，MinistryofAgriculture，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095;2KeyLabAnimalDiseaseDiagnosis，MinistryofAgriculture/InstituteofVeterinaryScienceofJiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014)Abstract:Twofragmentsofmrpgene(1801-2513bp)andepfgene(1783-2563bp)wereamplifiedfromgenomicDNAofStreptococcussuistype2isolatestrainSS2-1bypolymerasechainreaction(PCR)technique.ThePCRproductswerelaterclonedintoplasmidvectorpET-32aviarestrictionendonucleaseandthentransformedintohoststrainBL21.Throughrelevantendonucleasedigest,thepositiverecombinantbacteriawereidentified,whichwereexpressedbyIPTGofoptimalconcentration,respectively.Also,theantigenicityofexpressedrecombinantproteins(rMRPandrEPF)weredeterminedbyWestern-blot.Afterverifiedpositiveimmunity,thefragmentsofmrpandepflinkedbyPCRwasclonedintopET-32aagain.BytheabovemethodwithIPTG,therecombinantproteinconsistedofrMRPandrEPFwithmolecularweight74kDwasobtained.Next,theantigenicityanalysisbyWestern-blotshowedthattherecombinantproteinhadtheconservedepitopesofMRPandEPF,respectively.Inordertofurtherdeterminetheantigenicityofrecombinantproteins(rMRP,rEPFandrMRP-EPF),rabbitswereimmunized,positive(immunitywithbacterialvaccine)andnegativecontrols(non-immunity)wereset.After21d,challengedbyStreptococcussuistype2isolatestrainSS2-1,rMRP-EPFimmunizedrabbitswereprotectedmorethanalone.ComparedtorMRP25%,rEPF0%,bacterialvaccine100%,rMRP-EPFbearedprotectionratesof50%.ItisconcludedthatrMRP-EPFpossessesgoodantigenicity.Keywords:Streptococcussuistype2；Muramidase-releasedprotein；Extracellularproteinfactor；Fusionexpression；Epitope6期李明等：猪链球菌2型MRP与EPF基因串联表达蛋白及其免疫保护作用1265猪链球菌病是分布极广的人畜共患传染病[1～5]，根据荚膜多糖抗原性的差异可以分为35个血清型（1～34型及1/2型），其中2型是从病猪体内最常分离出的血清型[6,7],而且致病力较强。各年龄的猪均能感染猪链球菌,在断奶及混群时出现发病高峰[7,8]。猪链球菌能引起猪的败血症、支气管肺炎、脑膜炎、心内膜炎、关节炎、动脉炎、脓肿及新生仔猪死亡[7,9]，同时可感染人，所以是一种重要的人畜共患传染病。MRP和EPF是猪链球菌的两种重要的毒力因子，从病猪体内分离的菌株均含这两种因子，而从健康猪体内分离的菌株大多缺失[7,10]。从健康猪分离的猪链球菌2型常为MRP-EPF-，而从病猪分离的猪链球菌2型常为MRP+EPF+，可见MRP与EPF在致病过程中的重要作用[7,11],对这两种毒力因子的结构和功能尚待深入研究,本试验根据DNAstar软件分析，选取可能含有抗原决定簇肽段的MRP和EPF核苷酸序列，进行克隆和串联表达，对表达蛋白的免疫原性及其对家兔的免疫保护率进行了研究,并对表达蛋白的细胞生物学特性作了初步探索。1材料与方法1.1主要试剂PCR试剂盒，限制性内切核酸酶NcoⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ，pMD18-T载体，T4DNA连接酶，DL2000marker、DL15000marker均购自TaKaRa；胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司；Ni-NTAHisresin购自Novagen公司；酶标羊抗兔IgG、DAB显色试剂盒购自百赛。1.2菌种和质粒SS2-1由江苏省农科院兽医所分离保存;大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)及pET32a(+)原核表达质粒。1.3PCR扩增引物的设计和合成：按照GenBank中的mrp和epf基因序列，在欧瑜等[12]、徐淑菲等[13]研究基础上,结合DNAStar软件分析，选取MRP（1801～2513bp）和EPF（1783～2563bp）抗原性较强的一段氨基酸，分别设计两对引物MRPp1p2、EPFp3p4，在MRP和EPF引物两端分别加NcoⅠ、EcoRⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ限制性酶切位点和保护性碱基（由TaKaRa生物工程有限公司合成）。MRP基因引物：上游引物P15′-agtccatgggaacaaacgagtggg–3′下游引物P25′-ccggaattcacctgtcactgctcta–3′EPF基因引物：上游引物P35′-ggcgaattccttacttatggcttcact–3′下游引物P45′-agactcgagttgcttcattccgtgt–3′SS2-1基因组DNA的制备参照《精编分子生物学实验指南》。以SS2-1基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR循环条件为:95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，扩增35个循环，最后72℃延伸10min。1.4重组表达质粒pET32a-mrp、pET32a-epf的构建及鉴定扩增的PCR产物用胶回收试剂盒回收，连接于pMD18-TVector,DNA转化于感受态细胞DH5α中。通过蓝白斑筛选阳性菌落，分别命名为pMD18-T/mrp和pMD18-T/epf，提取质粒，分别进行PCR和酶切鉴定。琼脂糖电泳后回收各自的双酶切目的片段，将上一步回收的目的片段mrp和epf分别与酶切过的载体pET-32a连接，转化于BL21，PCR和限制性内切酶进行克隆的鉴定。阳性质粒分别命名为pET32a-mrp、pET32a-epf,对鉴定的阳性克隆测序（由TaKaRa生物工程有限公司合成）。1.5重组蛋白的诱导表达与免疫转印将MRP和EPF阳性菌落过夜培养物按2%的量接种于LB中，振荡培养至OD值在0.4～0.6，加IPTG至终浓度0.8mmol·L-1，继续振荡培养。收集菌体，加上样缓冲液进行SDS-PAGE（10%分离胶、5%浓缩胶）。本试验采用半干转印法[14],对MRP和EPF融合蛋白采用10%分离胶、5%浓缩胶进行SDS-PAGE，采用硝酸纤维膜（NC），将凝胶在Tris-Gly缓冲系统中进行转移电泳，0.65mA·cm-2转印95min，5%脱脂乳封闭，利用初纯的菌体MRP和EPF制备的多抗为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，DAB显色试剂盒显色。待确定MRP和EPF融合蛋白都具有免疫原性，继续以下试验。1.6串联表达载体pET32a-mrp-epf的构建及鉴定提取已构建的原核表达载体pET32a-mrp、pET32a-epf质粒各自进行双酶切并纯化，通过PCR串联两片段,将目的片段定向克隆到表达载体pET-32a中，重组质粒转化入大肠杆菌BL21中。阳性质粒命名为pET32a-mrp-epf。将挑选出的重组质粒pET32a-mrp-epf用mrp的上游引物P1与epf下游引物P4进行PCR，扩增大约1500bp的DNA片段。并对重组质粒pET32a-mrp-epf1266中国农业科学38卷经NcoI、XhoI双酶切鉴定与免疫转印鉴定(方法同上)。1.7兔免疫保护试验在免疫活性测定的基础上，将串联表达的融合蛋白经超声波仪破碎并测定其浓度，制备疫苗免疫40日龄1～1.2kg的新西兰兔(由江苏省农业科学院种兔场提供)，同时设EPF免疫组、MRP免疫组、全菌苗组与空白对照组。同时检测融合蛋白刺激兔体产生抗体情况。30只新西兰兔随机分为6组，每组5只，每只免疫400µg融合蛋白。分组情况为：M组(表达蛋白MRP组)、E组(表达蛋白EPF组)、R组(串联表达融合蛋白组)、S组