一份国自然标书模板及注解

申请代码H0206受理部门收件日期受理编号解除保护国家自然科学基金申请书(2014版)资助类别：面上项目亚类说明：附注说明：项目名称：外源性多胺恢复老龄大鼠心肌缺血预适应保护作用的机制研究申请人：王二电话：[phone]依托单位：广州中医药大学通讯地址：广州市机场路16号邮政编码：510405单位电话：[phone]电子邮箱：[e-mail]申报日期：2014年3月1日国家自然科学基金委员会国家自然科学基金申请书2014版第2页版本1.004.984基本信息yoKWT/OQ申请人信息姓名王二性别男出生年月1984年12月民族汉族学位硕士职称副教授每年工作时间（月）10电话[phone]电子邮箱[e-mail]传真[phone]国别或地区中国个人通讯地址广州市机场路16号工作单位广州中医药大学/第一附属医院主要研究领域心肌干细胞依托单位信息名称广州中医药大学联系人张坚电子邮箱[e-mail]电话[phone]网站地址合作研究单位信息单位名称中山大学[在此录入修改]项目基本信息项目名称外源性多胺恢复老龄大鼠心肌缺血预适应保护作用的机制研究英文名称aaa资助类别面上项目亚类说明附注说明申请代码H0206:冠状动脉性心脏病H2501:老年医学基地类别研究期限2015年1月—2017年12月申请经费70.0000万元中文关键词冠心病;心肌梗死英文关键词aa;bb国家自然科学基金申请书2014版第3页版本1.004.984中文摘要(限400字)：：缺血预适应（IPC）是缺血心肌保护的重要内源性机制，但老龄心肌对IPC刺激减敏，具体机制不清。多胺具有广泛的生物学功能，最新研究发现其可通过诱导自噬发挥抗衰老作用。已知老龄心肌多胺减少且自噬能力降低。前期我们已证实，缺血-再灌注（IR）心肌多胺减少，外源性精胺具有保护作用；多胺是介导成年大鼠IPC心肌保护的信号分子。据此，我们推测“外源性多胺可能通过诱导自噬恢复老龄心肌IPC保护作用”。本课题首先观察不同鼠龄大鼠IPC心肌的多胺代谢，同时观察外源性多胺恢复老龄心肌IPC保护作用的能力并探讨其机制。重点关注其对自噬、线粒体损伤及凋亡的影响。再给予调控自噬和mPTP开放干预，拟证明多胺发挥作用依赖的信号级联。进一步应用分离的老龄心肌细胞及线粒体确定多胺作用的效应靶点。本课题首次在器官、细胞及分子水平上探讨多胺代谢、细胞自噬在老龄心肌IPC保护中的作用及机制，为老龄心肌IR损伤的防治提供新思路英文摘要(限3000Characters)：aa国家自然科学基金申请书2014版第4页版本1.004.984项目组主要参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请人）编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话电子邮箱项目分工每年工作时间（月）1王一1956-2-1男教授博士广州中医药大学[e-mail]研究设计82王三1969-5-5男教授博士广州中医药大学[e-mail]心肌细胞培养63王四1992-1-1女医师硕士广州中医药大学[e-mail]线粒体功能测定94王五1966-6-6男高级统计师硕士中山大学[e-mail]统计分析95王六1995-1-1女硕士生学士广州中医药大学[e-mail]动物实验106[在此录入修改]7[在此录入修改]8[在此录入修改]9[在此录入修改]总人数高级中级初级博士后博士生硕士生6411说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报（含申请人），总人数由各分项自动加和产生。国家自然科学基金申请书2014版第5页版本1.004.984经费申请表（金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费55.50001.科研业务费8.5000（1）测试/计算/分析费2.5000激光扫描共聚焦、RealtimePCR与流式细胞仪等检测，图像处理与分析（2）能源/动力费1.5000水电费（3）会议费/差旅费2.5000参加国内学术会议（4）出版物/文献/信息传播费2.0000文献检索、论文发表费（5）其他2.实验材料费47.0000（1）原材料/试剂/药品购置费40.0000购买试剂、试剂盒、抗体、合成siRNA、购买引物及所有实验用耗材（2）其他7.0000购买实验动物及动物饲料费，购置高效液相色谱柱，氧电极等消耗性仪器配件支出3.仪器设备费0.0000（1）购置0.0000（2）试制0.00004.实验室改装费5.协作费二.国际合作与交流费7.50001.项目组成员出国合作交流4.0000到国外开会及去国外实验室交流学习支出2.境外专家来华合作交流3.5000请国外专家来实验室交流三.劳务费3.5000直接参加项目研究的研究生、博士后的劳务费用四.管理费3.5000不得超过申请经费的5%合计70.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计0.0000国家自然科学基金申请书2014版第6页申请者在撰写报告正文时，请遵照以下要求：1、请先选定项目基本信息中的资助类别，再填写报告正文；2、在撰写过程中，不得删除系统已生成的撰写提纲（如误删可点击“查看报告正文撰写提纲”按钮，通过复制/粘贴恢复）；3、请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处；4、对于正文中出现的各类图形、图表、公式、化学分子式等请先转换成JPG格式图片，再粘贴到申请书正文相应位置5、本要求将作为申请书正文撰写是否规范的评判依据，请遵照要求填写。查看报告正文撰写提纲报告正文报告正文：参照以下提纲撰写，要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出。（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：1．项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）；（1）老龄心肌缺血/再灌注（IR）损伤与缺血预适应（IPC）保护人口老龄化是当今世界一个突出性的社会问题，我国人口老龄化发展速度尤其之快。提高老年人的生活质量，已经成为全社会研究的重要课题。冠心病是引起老年人死亡的最常见原因，其基本病理生理过程是心肌缺血，尽早恢复缺血心肌的血液供应能够挽救缺血心肌，但再灌注引起缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusioninjury,IRI）。缺血预适应（ischemicpreconditioning,IPC）是心肌保护的新概念，是迄今为止最强的内源性心肌缺血保护方法。但由于老龄心肌细胞发生退行性变，心肌细胞自噬能力降低，线粒体功能下降（mtDNA突变），氧化应激增强，老龄导致内源性保护物质的生成减少以及IR损伤中发重要作用的蛋白质（膜受体、下游的激酶、磷酸酶、促炎细胞因子等）表达/活性发生改变等，导致老龄心肌对缺血预适应刺激的敏感性减弱或消失【1,2】。因此，迫切需要有效的措施改善或恢复老龄心肌对缺血预适应刺激的敏感性，提高老龄心肌抗缺血损伤的能力，进而提高老年人的生存率。（2）多胺代谢带有多价正电荷的小分子多胺（polyamine,PAs）包括精胺（spermine,SP）,精脒（spermidine,SPD）及腐胺（putrescine,PU），广泛存在于迄今人们所研究的所有真核细胞和原核细胞内，为细胞的生长、分化和增殖所必需，并在许多病理过程中发挥重要作用【3】。目前，小分子多胺作为一国家自然科学基金申请书2014版第7页种内源性信号分子，已成为国际研究的热点【3-24】。生物体内多胺水平受精确调控。鸟氨酸脱羧酶（ornithinedecarboxylase,ODC）和精脒/精胺乙酰转移酶（spermidine/spermineN1-acetyltransferase,SSAT）分别为多胺合成与分解代谢的限速酶。ODC催化鸟氨酸脱羧生成腐胺，腐胺连接到S-腺苷甲硫氨酸上，在S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（S-adenosylmethioninedecarboxylase,SAMDC）的催化下脱羧生成精脒，精脒通过精胺合成酶催化产生精胺。ODC可被多种生长因子、原癌基因、肿瘤促进剂和应激刺激等激活【4,5】；SSAT催化多胺的逆转化分解代谢，依次催化精胺转化为精脒，精脒转化为精胺。此分解反应过程中产生两种有毒代谢副产物3-氨基丙醛和过氧化氢（H2O2），因此，SSAT过度激活（多胺分解代谢增强）引起组织细胞损伤【6】。（3）多胺的生物学作用多胺具有广泛的生物学功能，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡、调控线粒体通透转运（MPT）、调控离子通道、促细胞增殖及在细胞内信号转导中发挥重要作用等【7-15】。文献报道，连续3天给小鼠腹腔注射精胺(10mg/kg)能明显抑制内毒素诱导的血清中炎症介质的释放【7】；多胺可抑制幅射等所引起的DNA损伤和脂质过氧化。活性氧可导致DNA断裂和/或硷基修饰，发生程序性细胞死亡，天然多胺含有类似叠氮钠(单线态氧淬灭剂)的氨基而发挥保护作用【8】；多胺可通过与细胞内带负电荷的生物大分子如核酸及蛋白质等结合稳定染色质、核酶、核酸和/或细胞膜。在分离的肝脏线粒体，精胺通过清除羟自由基，维持谷胱苷肽和巯基的还原状态，抑制线粒体通透转运孔（mPTP()开放【9】。在小鼠WEH1231B细胞和人的T细胞，多胺合成抑制剂引起线粒体膜电位（△ψm）下降和caspase-3激活，外源性多胺可逆转之【10】；细胞内精胺负责内向整流钾通道（irK1）的固有门控和整流特性，精胺通过调控谷氨酸盐受体的某些亚型，影响神经系统神经元和神经胶质细胞的兴奋性和Ca2＋的内流【11】；多胺可直接激活TPK和MAPK，促进原癌基因c-myc,c-jun和c-fos的表达【12】。RTK，PI3K和PKC抑制剂均能抑制生长因子诱导的ODC的磷酸化【13】。多胺为生长过程所必需，但过度产生也常伴有致癌和致组织细胞损伤作用【14,15】。随年龄增加哺乳类动物组织器官多胺水平降低（肝、肾、骨骼肌、心脏、肺等）,多胺合成限速酶ODC也呈相同下降趋势【16】。在老龄的组织细胞，激素诱导ODC激活的能力也明显降低【17】；健康人血清及尿液中多胺水平也随年龄增加而降低【18】。目前已知，多种食物中富含多胺包括蔬菜、水果、鱼、肉、蛋、奶以及发酵食物如奶酪等，摄食富含多胺的食物对老年人的健康有益【19】。动物实验也证明，小鼠长期摄食富含多胺的食物，能明显降低老化相关的疾病，如肾小球硬化、动脉硬化，降低死亡率【20,21】。最新研究显示（2009,2010年文献），多胺可通过诱导细胞自噬延长生物体的寿命，具有抗衰老作用【22-24】。Morselli的研究显示，精脒能够诱导培养的酵母、线国家自然科学基金申请书2014版第8页虫、果蝇、小鼠细胞及人的肿瘤细胞自噬，敲除或沉默重要的自噬相关基因（如atg-7，bec-1）取消了精脒延长寿命的作用；小鼠的饮水中加入多胺，也能显著减少衰老引起的氧化应激和细胞坏死【23】。Eisenberg证明精脒延长寿命的机制是通过抑制组蛋白乙酰转移酶使组蛋白去乙酰化，进而转录激活自噬相关基因atg7,atg11和atg15,诱导细胞自噬【24】。（4）衰老心肌自噬能力下降及其影响的下游事件自噬是存在于真核细胞中的生命现象，通过自噬清出细胞内受损的蛋白质和细胞器，维持细胞内稳态，对生物体正常发育及防治老化有积极的作用。分子水平上的研究发现，调节自噬和调节衰老的信号通路之间存在相互联系【25】。研究显示，随着年龄增加心肌细胞自噬能力明显降低，导致变性的蛋白质和损伤的细胞器不能有效被清除,细胞稳态发生变化【26】。衰老心肌线粒体自噬减少导致线粒体功能异常