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实验三叶绿体和线粒体的分离与观察商建秀实验师：刘伟助教：陈连阁分离叶绿体和线粒体的意义1.分离和制备有活性的离体叶绿体是研究叶绿体的结构功能、光合作用原理及遗传控制机理的前提。2.对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。实验目的•1.掌握差速离心技术分离细胞器的一般原理和方法。•2.对分离得到的叶绿体及线粒体进行观察及活性鉴定。实验原理1.差速离心匀浆、超声、研磨使细胞膜破裂，释放各种细胞器在一定的离心力下，不同细胞器的沉降速度不同。用不同的离心力，将各种不同亚细胞组分分离。•细胞核/叶绿体、线粒体/溶酶体/过氧化物酶体、微体、核糖体等。由于细胞核与叶绿体的沉降速度相近，二者通过离心的方法较难分离。2.细胞器的分离介质和条件•采用缓冲溶液,接近细胞质的分散相,保持细胞器的结构和酶的活性；•叶绿体用0.35M氯化钠或0.4M蔗糖溶液；•线粒体用0.25M蔗糖溶液；•整个操作过程样品要保持在0℃-4℃,避免酶失活。3.对分离的细胞器进行鉴定•叶绿体用0.01%吖啶橙荧光染料•线粒体用1%詹纳斯绿B染液鉴定活性和纯度。实验材料（一）器材：普通离心机,研钵,天平,载玻片,盖玻片,滤纸,试管,试管架,移液管,滴管,烧杯,离心管（二）材料：菠菜叶片,玉米黄化苗（三）试剂：提取缓冲液：2mMNa2-EDTA;50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4),0.5%BSA(用前加入)0.35M氯化钠-提取缓冲液,0.25M蔗糖-提取缓冲液，1%詹纳斯绿B(JanusgreenB)染液0.3M甘露醇溶液实验步骤.菠菜叶绿体的分离•1.选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称3g置于研钵中，加入15ml0.35M氯化钠－提取缓冲溶液。•2.研磨成匀浆。•3.用6层纱布过滤,滤液盛于烧杯中。•4.取滤液12ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。•5.将上清液在3000r/min下离心5min，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。•6.沉淀用1ml0.35M氯化钠－提取缓冲液悬浮。•7.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片。菠菜叶绿体的分离实验流程图洗净、剪碎研磨，过滤两次离心沉淀悬浮1000rpm2min取上清3000rpm5min叶绿体15ml0.35M氯化钠-buffer1ml0.35M氯化钠-buffer3g菠菜第一步低速离心：去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞光学显微镜玉米黄化幼苗线粒体的分离•1.玉米幼苗约5克，加三倍体积（约8ml）0.25M蔗糖-提取缓冲液，在预冷的研钵内快速研磨成匀浆。•2.8层纱布过滤，滤液经4℃3000g离心10min,去除核和杂质。•3.上清液用4℃10000g离心10min，沉淀为线粒体。•4.沉淀用2ml0.25M蔗糖-提取缓冲液重悬，同上离心一次(4℃10000g离心10min)。•5.沉淀存于200μl0.3M甘露醇中。•6.取分离的线粒体滴在载玻片上，滴加1%詹纳斯绿B溶液染色10分钟后,用光学显微镜观察。玉米黄化幼苗线粒体的分离实验流程图玉米黄化幼苗剪碎、研磨，过滤分成小管离心取上清离心沉淀悬浮离心3000g10min10000g10min200μl0.3M甘露醇5g+8ml0.25M蔗糖-buffer詹纳斯绿B溶液染色,观察4度10000g10min沉淀悬浮注意事项•4人/组2人/叶绿体，2人/线粒体•注意：离心机的平衡!•请用天平平衡！小型常温离心机小型冷冻离心机小型常温离心机小型冷冻离心机取新鲜叶片，从叶片的下表面撕取表皮制成装片，在普通显微镜及荧光显微镜下分别观察气孔及气孔周围的叶绿体。？？？线粒体詹纳斯绿B染色结果与讨论结果：•1.绘图并描述光镜下分离的叶绿体的形态及菠菜下表皮中叶绿体的形态。•2.描述提取到的线粒体的形状及染色情况（如实验结果不理想，分析造成实验失败的原因。）思考题1.植物中分离纯化的叶绿素的酒精溶液在透射光下为翠绿色，而在反射光下为棕红色。植物中分离出的叶绿体是否也有同样的现象？请从叶绿体的功能的角度解释为什么。2.在细胞器分级分离的实验中，叶绿体分离所用的等渗溶液势0.4M的蔗糖，而分离线粒体却用0.25M的蔗糖，请从两种细胞器功能上的差异解释为什么用不同浓度的等渗溶液。如何区别线粒体?Rcf(g）=1.118X10-5XR（转子半径cm）XN2（转速rpm）渗透压•恰好能够阻止水分子通过半透膜从浓度较低的溶液移向浓度较高的溶液的在较高浓度溶液的液面上施加的额外压强称为渗透压。渗透压•溶液渗透压，简单的说，是指溶液中溶质微粒对水的吸引力。溶液渗透压的大小取决于单位体积溶液中溶质微粒的数目：溶质微粒越多，即溶液浓度越高，对水的吸引力越大，溶液渗透压越高；反过来，溶质微粒越少，即与无机盐、蛋白质的含量有关。在组成细胞外液的各种无机盐离子中，含量上占有明显优势的是Na+和Cl-，细胞外液渗透压的90%以上来源于Na+和Cl-。在37℃时，人的血浆渗透压约为770kPa，相当于细胞内液的渗透压。