动物实验技术的方法

第一节动物实验前的准备第二节动物实验基本操作技术动物因素：包括遗传因素、性别、年龄、疾病因素环境因素：包括理化因素（温度、湿度、通风、光照、噪声、有害气体等）、营养因素（饲料、饮水等）、微环境（房舍、笼具、垫料、饮食器具等）、生物因素（饲养密度、微生物、寄生虫等）人为因素：包括动物的饲养管理，动物实验的设计、操作技术及结果的处理等动物实验前要进行一系列的准备工作，包括理论准备、条件准备、预备实验。理论准备：了解动物实验的基础理论知识、选题立项和设定假设，研究计划和方案的制订、实验方法的选择、技术参考文献查阅等。条件准备：仪器设备的备置与校准、药品的配制、器械的准备、实验动物的购入、实验场所消毒与器具配套等等。预备实验：对动物实验试探性摸索，对开展好动物实验研究十分重要。一、动物实验前的理论准备1、了解有关实验动物方面的基础知识首先要了解有关实验动物科学方面的基础理论，特别是熟悉实验动物的生物学特性，对开展动物实验研究将十分有益。其次要掌握有关动物实验方法学方面的基础知识和基本技能。2、正确选题立项和设定假设选题应遵守以下四项基本原则：科学性，是指选题应建立在前人的科学理论和实验基础之上，而不是毫无根据的胡思乱想。目的性，是指选题应具有明确的理论意义和实践意义。创造性，指选题应具有自己独到之处，或提出新规律、新见解、新技术、新方法，或是对旧有的规律、技术、方法有所修改、补充。可行性，是指选题应切合研究者的学术水平、技术水平和实验条件，能够顺利得以实施。假说是预先假定的答案或解释，亦即是实验的预期结果。对于动物实验研究来说，假说是十分必要的。许多动物实验研究的目的就在于验证临床上的假说是否正确。假说是实验研究设计的前提。如果没有假说，实验和观察就会失去目标。假说关系着实验研究的目的性、计划性和预见性。对假说既应努力加以验证，尤应适时加以抛弃，重新建立新的假说，再加以验证。这样才有可能使正确的假说上升为结论、原理和学说。3、实验研究计划和方案的制订实验研究计划和方案的制订，是指对动物实验研究中涉及的各项基本问题的合理安排。设计是否周密合理，直接影响实验研究的结果是否准确可靠。研究计划和方案的制订应根据具体的实验情况而定。提高实验研究设计水平和技巧对动物实验研究具有十分重要的意义。实验动物的选择根据不同目的选用实验动物选用相应的合格实验动物(许可证)制定动物实验方案实验目的负责人姓名供试品和对照品的名称、缩写名、代号给药途径、剂量、频率、用药期限实验选择理由实验动物种、系、数量、年龄、性别、体重范围和来源实验动物识别方法实验的环境条件饲料的名称或代号实验用品的类型4、实验方法的选定实验方法按学科可分为生理学方法、生物化学方法、生物物理方法、免疫学方法等等；按性质可分为形态学方法、机能学方法；按范围可分为整体综合方法和局部分析方法；按水平可分为整体水平、器官水平、细胞水平、分子水平、量子水平等等。无论选择何种实验方法，均应保证以下几点：1、可靠性，即切实可行，稳定可靠，是受大家公认的方法，也称经典方法；2、优越性，即指实验方法既具有先进的一面，又便于与其它实验方法相互配合，故也称先进性和协同性；3、创造性，即实验方法的创新或改良。动物实验前的条件准备的内容指准备好实验仪器、药品、试剂和实验动物等。条件准备的要求是尽可能使实验手段和实验方法标准化。比如，实验仪器必须校准；药品的纯度应有明确的要求，试剂的配制必须严格遵守操作规程；称量药品应使用精确的计量仪器等等。预备实验是在动物实验前对正式实验进行初步实验，其目的在于检查各项准备工作是否完善，实验方法和步骤是否切实可行，测试指标是否稳定可靠，初步了解实验结果与预期结果的距离，从而为正式实验提供补充、修正的意见和经验，是动物实验必不可少的重要环节。预备实验可使用少量动物进行，实验方法和观察指标应和正式实验一样。但是，预备实验的结果不能归入正式实验的最后结果中一同分析。动物实验的设计是动物实验过程的依据，是实验数据处理的前提，也是提高实验研究质量的重要保证。严密而合理的动物实验设计与分组，不但对实验结果和误差有比较准确地估计，最大限度的获得丰富而可靠的资料，而且还可提高工作效率，避免因实验设计不当，造成人力、物力的浪费，甚至前功尽弃的不良结果。因此，做好动物实验设计是一项十分重要的工作。一、动物实验设计的基本原则实验研究主要是通过对样本的研究而得出结论。要将样本的结论外推到总体，必须尽量使样本能够真实的代表总体。然而，实验动物的种系和个体差异、实验环境差异、仪器的稳定性、药品的纯度、样本的大小等因素都可能产生实验误差，影响样本结果的代表性。为避免或缩小误差，实验设计时必须注意误差控制。（一）对照性原则实验研究一般都把实验对象随机分设对照。可以采用同体对照，即同一动物在施加实验因素前后所获得的不同结果和数据各成一组，作为前后的对照，或同一动物在施加实验因素的一侧与不施加实验因素的另一侧做左右的对照；也可采用异体对照，即两组的动物数应相等或相近，一组施加实验因素，一组不施加实验因素。空白对照模型对照实验条件对照阳性对照（二）一致性原则一致性原则是在实验中实验组与对照组除了处理因素不同外，非处理因素基本保证均衡一致。均衡一致是处理因素具有可比性的基础。动物实验时研究者应选用合理的设计方案，以控制干扰因素趋于一致。为获得可靠的实验结果，最重要的是实验过程中保证实验组和对照组之间除被研究的实验处理因素有所不同外，实验对象、实验条件、实验环境、实验时间、药品、仪器、设备、操作人员等等，均应力求一致。（三）重复性原则重复性原则是指同一处理要设置多个样本例数。重复的主要作用是估计试验误差、降低试验误差和增强代表性，提高实验结果的精确度，同时为体现结果的真实性，保证实验结果能在同一个体或不同个体中稳定地重复出来，也需要足够的样本数。样本数过少，实验处理效应将不能充分显示；样本数过多，又会增加实际工作中的困难。因此在进行实验前必须确定最少的样本例数。1、一般估测的样本数小动物（小鼠、大鼠）每组10-30例：计量资料每组不少于10例，计数资料每组不少于30例；中动物（豚鼠、家兔）每组8-20例：计量资料每组不少于8例，计数资料每组不少于20例；大动物（犬、猪）每组6-20例：计量资料每组不少于6例，计数资料每组不少于20例。2、按统计学方法测算的样本数（1）配对试验动物数目的确定：可用配对试验的t检验法，推倒试验所需动物数目，欲达到显著水平α=0.05时，则样本的含量可用下式确定：n=[(t0.05sd)2]/d2sd为前人试验或经验所得各组间差异的方差d为要求达到所预期的差异显著时的均数差值t0.05为在一定的df下，α=0.05的t值首次估计将用n≥30时，t=2代入。（2）非配对试验动物样本数的确定：用非配对试验的t检验法，推算所需试验的动物数目。当两组试验样本数相等，n1=n2时，欲达到显著水平α=0.05，则样本含量可用下式来确定：n=[t0.052(s1+s2)]/(x1-x2)2s1、s2分别为试验或经验所得的两组的样本标准差。当n1=n2时，s12=s22=s2。(x1-x2)为要求达到所预期的差异显著时的均数差值t0.05为在一定的df下，α=0.05的t值首次估计将用n≥30时，t=2代入。（四）随机性原则随机性原则就是按照机遇均等的原则来进行分组。其目的是使一切干扰因素造成的实验误差尽量减少，而不受实验者主观因素或其它偏性误差的影响。随机化的手段可采用编号卡片抽签法，随机数字表或采用计算器的随机数字键。（五）客观性原则动物实验设计中要力戒主观偏性干扰，选择观察指标时，不用或尽量少用带主观成分的指标。结果判断要客观，更不能以主观的意愿对结果或数据作任意的改动和取舍。二、动物实验设计方法（一）单组比较设计单组比较设计是指在同一个体上观察实验处理前后某种观测指标的变化。优点是能清楚个体间生物差异，但不适用于在同一个体上多次进行实验和观察的情况。（二）配对设计（paireddesign）是将动物按某些特征或一定条件配成对，再将每对中两个动物随机分配到两个不同处理组中。配对的因素是影响试验效应的主要非处理因素，如动物性别、体重，两组动物取得均衡进行实验，以减少误差及动物间的个体差异。（三）随机区组设计是配对设计的扩大。将全部动物按体重、性别及其他条件等分为若干组，每组中动物数目与拟划分的组数相等，体质条件相似，再将每个区组中的每一只动物进行编号，利用随机数字法将其分配到各组。（四）完全随机设计（completelyrandomdesign）：是将各个实验对象随机分配在各组，并从各组实验结果的比较中得出结论。通常用随机排列表法进行完全随机化分组。（五）交叉设计（cross-overdesign）：是在自身配对设计基础上发展起来的。该设计考虑了一个处理因素（A、B两水平），两个与处理因素无交互作用的非处理因素（试验阶段和受试对象）对试验结果的影响。首先将条件相近的观察对象配对并依次编号，再用随机的方法将各对观察对象分配到A、B两组；其中一个观察对象在第Ⅰ阶段接受A处理，第Ⅱ阶段接受B处理；另一个观察对象在第Ⅰ阶段接受B处理，第Ⅱ阶段接受A处理。因而要求观察对象的例数为偶数。由于A、B两种处理在全部试验过程中“交叉”进行，故称为交叉试验设计。（六）拉丁方实验设计（Latinsquaredesign）：是按拉丁方阵的字母、行和列安排实验（或试验）的三因素等水平的设计。该设计同时考虑三个因素对试验结果的影响。◦根据实验目的选择合适的实验室及饲养室◦动物实验室要与实验动物同等级别◦饲养室应符合实验动物的生活习性及国家实验动物设施各项标准实验人员着装实验服连身衣脚套头套口罩手套有资格证者无资格证者培训合格后登记注册授权区间进入程序一更淋浴二更风淋进入授权实验区进行完实验后非洁净走廊一更二更淋浴动物实验可省略（1）一般准备进屏障区域要换穿无菌隔离服，戴好口罩及帽子。（2）口罩：要盖住鼻孔，帽子要盖住全部头发。剪短指甲，并除去甲缘下积垢。手臂皮肤破损有化脓感染时，不能接触动物。（3）穿无菌隔离服和戴手套的方法目前多数屏障设施都采用经高压蒸汽灭菌的胶手套。如用胶手套，应先戴手套，再穿无菌隔离服。1.概念将手涂满肥皂泡沫并对其所有表面进行强有力的短时揉搓，然后用流动水冲洗的过程，称洗手。2.目的清除手上的微生物，切断通过手传播感染的途径。3.方法和步骤（六步洗手法）每次接触动物后应立即进行手部清洗和消毒。离开实验区时，脱隔离服后再次用流水及肥皂冲洗手，每次冲洗1分钟左右。手消毒用0.3%~0.5%碘伏消毒液或快速手消毒剂(洗必泰、新洁尔灭醇、75%酒精等)揉搓1-3分钟。⑴洗手时操作程序正确，手的各个部位要洗到⑵洗手时水不可外溅不污染周边环境及工作服⑶洗手后不可检出致病微生物⑷在下列情况下应认真洗手：①进入和离开动物实验室前②接触干净物品前和处理污染物后③无菌操作前后，接触动物伤口前后④戴无菌手套前和脱手套后⑤护理任何动物前后（1）选择作用速度快、不损伤皮肤、杀菌效果好的消毒液。（2）可选择75％酒精、0.5％碘伏、0.5％洗必泰酒精、含氯消毒剂或过氧乙酸等。一、分组编号二、捉拿保定三、给药四、麻醉五、体液采集六、急救措施七、术后保护八、安乐死九、尸体处理（1）实验动物分组①分组原则实验动物分组应严格按照随机分组的原则进行，使每只动物都有同等机会被分配到各个实验组中去，尽量避免人为因素对实验造成的影响。②建立对照组实验动物分组时应特别注意建立对照组。对照组可分自身对照组和平行对照组。标记编号方法应保证编号不对动物生理或实验反应产生影响，且号码清楚、易认、耐久和适用。目前常用的标记编号方法有电子芯片植入法、染色法、耳孔法、烙印法、挂牌法等标记编号方式。此外还有针刺法、断趾编号法、剪尾编号法、被毛剪号法、笼子编号法等。（注意：某些陈旧的动物标记编号方法应注意对动物造成的痛苦，尽量不用）射频识别（RadioFrequencyI