GST-pull-down实验技术

GSTpull-down实验技术主讲：段志强WesternBlotGSTpull-down原理GSTpull-down实验流程WesternBlotGSTpull-down原理：GSTpulldown是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法。原理：利用DNA重组技术将已知蛋白与GST(GlutathioneStransferase)融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。WesternBlotGSTpull-down原理：基本原理：假定A蛋白和B蛋白可能有相互作用，将纯化的融合GST标签的A蛋白和纯化的B蛋白以及能特异结合GST的Sephrose4Bbeads孵育一定时间，充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，通过Westernblotting检测，可以看见GST-A和B分别对应的条带,表明A和B因相互作用而被GST-Apull-down；而GST对照组始终仅有一个条带。WesternBlotGSTpull-down示意图WesternBlotGSTpull-down应用用于验证两个已知蛋白的相互作用筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白WesternBlotGSTpull-down流程GST-A融合蛋白的制备•B蛋白的制备•体外蛋白的结合•Westernblot检测WesternBlot1.1GST-A融合蛋白的表达1.2GST-A融合蛋白的纯化1.GST-A融合蛋白的制备WesternBlot1.1GST-A融合蛋白的表达1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1:50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5mlLB(Amp＋)，37℃，200rpm培养过夜；2、将过夜培养物按1:100比例接入200mlLB(Amp＋)，220rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.6;3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白（IPTG0.5mM，20℃，200rpm培养10~16小时）;4、诱导适当时间后，4℃，5000rpm/min离心10min后弃上清（如需要该步沉淀能保存在-80℃）；WesternBlot1.1GST-A融合蛋白的表达5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1mlPBS重悬，并加入PMSF；6、冰上超声沉淀重悬液：5S间隔5S至悬液透明（一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1mlPBS重悬液超声6~9min可透明）;7、12000rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L。WesternBlot1.2GST-A融合蛋白的纯化1、在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的50%GlutathioneSepharose4B，4℃缓慢摇动，反应30~60min；2、3000rpm/min，4℃离心3min，弃上清。该Sepharose上结合了GST-A融合蛋白。3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次，3000rpm/min，4℃离心3min，弃上清;4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；WesternBlot1.2GST-A融合蛋白的纯化5、如果用于检测，在Sepharose加入15~20微升1×蛋白电泳上样缓冲液，于沸水中煮5~10min。6、12000rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。WesternBlotB蛋白的来源：1.1(His)-B融合蛋白的原核表达与纯化1.2(HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达2.B蛋白的制备WesternBlot1、活化冻存菌种His和His-B：按1:50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5mlLB(Amp＋)，37℃，200rpm培养过夜；2、将过夜培养物按1:100比例接入200mlLB(Amp＋)，220rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.6;3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白（IPTG0.5mM，28℃，200rpm培养10~16小时）;4、诱导适当时间后，4℃，5000rpm/min离心10min后弃上清（如需要该步沉淀能保存在-80℃）；1.1.1(His)-B融合蛋白的原核表达WesternBlot5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1mlPBS重悬，并加入PMSF；6、冰上超声沉淀重悬液：5S间隔5S至悬液透明（一般可溶性蛋白：10ml菌液沉淀用1mlPBS重悬液超声6~9min可透明）;7、12000rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L。1.1.1(His)-B融合蛋白的原核表达WesternBlot1.1.2(His)-B融合蛋白的纯化1、在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的Ni-NTA珠子，4℃缓慢摇动，反应30~60min；2、3000rpm/min，4℃离心5min，弃上清。该Ni-NTA珠子上结合了His-B融合蛋白。3、在管中加入预冷的200微升WashBuffer（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将珠子洗涤一次，3000rpm/min，4℃离心3min，弃上清;4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸净但不吸走珠子），即获得结合有His融合蛋白的Ni-NTA；WesternBlot1.1.2(His)-B融合蛋白的纯化5、加入适量体积ElutionBuffer，不必吹打，晃动洗脱蛋白。3000rpm/min，4℃离心5min，吸净上清，His-B融合蛋白即在上清中；6、如果用于检测，取10微升样品，加入10微升1×蛋白电泳上样缓冲液，于沸水中煮5~10min；7、12000rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。WesternBlot1、将编码B蛋白的ORF克隆到编码标签蛋白（如HA/Myc/Flag）的真核表达载体上，进行细胞转染；2、转染后36~48h，取出细胞，用预冷PBS洗2遍;3、加入适量体积1×RIPA（含PMSF），于冰上或4℃裂解细胞10~30min;4、12000rpm/min，4℃离心5min，取上清保存在-80℃或进行下一步实验。1.2(HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达WesternBlot3.体外蛋白的结合1、将结合有GST-A融合蛋白的Sepharose4B悬浮在适量体积缓冲液中，加入20~30微升含有B蛋白的溶液（原核表达或真核表达产物），同时采用结合有GST蛋白的Sepharose作为阴性对照；2、在水平摇床上4℃晃动4~8h；3、3000rpm/min，4℃离心3min，弃上清（注意不要扰动底层的Sepharose）；4、加入预冷的200微升缓冲液对Sepharose进行洗涤（沿壁加入，不要直接冲击Sepharose，随后轻柔晃动，使Sepharose重悬即可;WesternBlot3.体外蛋白的结合5、3000rpm/min，4℃离心3min，弃上清（注意不要扰动底层的Sepharose）；6、重复步骤5三次;7、吸干Sepharose上面的液体后，加入20~30微升1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于-20℃备用；8、做SDS-PAGE和Westernblot检测另一个蛋白。WesternBlot4.Westernblot检测谢谢大家！