ACE抑制活性测定

一、试剂与溶液（一）试剂1.马尿酸（hippuricacid，Hip），美国Sigma公司或购自中国医药集团上海化学试剂公司2.马尿酰-组氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leutetrahydrate，HHL），美国Sigma公司3.血管紧张素转化酶（ACE），0.1U，美国Sigma公司或瑞士Fluka公司4.乙腈，HPLC级5.硼酸（H3BO3）、硼砂、氯化钠均为分析纯（二）试液配制1.0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液(pH8.3，含0.3mol/LNaCl)：称取12.37g硼酸，加热溶解后定容至1L备用。称取19.07g硼砂（Na2B4O7.10H2O），加热溶解后定容至1L备用。量取175mL硼砂溶液和325mL硼酸溶液混合在一起，用HCl或者NaOH调节至pH8.3，然后再加入17.532gNaCl，定容至1L即可。2.降血压肽溶液：用0.1mol·L-1硼酸缓冲液（pH8.3，含0.3mol·L-1NaC1）配制成适当浓度的降血压肽溶液。3.ACE溶液：取0.1UACE溶于1mL0.1mol·L-1硼酸缓冲液（pH8.3，含0.3mol·L-1NaCl）。4.HHL溶液：取适量HHL，用0.1mol·L-1硼酸缓冲液（pH8.3，含0.3mol·L-1NaC1）配成6.5mmol·L-1HHL溶液。5.1mg/mL马尿酸标准液：取适量马尿酸标准品，双蒸水配制马尿酸标准液。二、分析方法（一）反应液的制备分别向样品管（B）和空白管（A）加入加入ACE溶液5μL，样品管加入10μLACEI，空白管10μL缓冲液，37℃温育5min后加入50μLHHL溶液，在37℃条件下反应30min后，后加入85mL1.0mol/LHCl中止反应,得到反应液。0.45μm过滤后用于HPLC分析。（二）色谱条件1.色谱柱：VYDAC238EV54C18（250mm×4.6mm，5µm）2.流动相与色谱条件：乙腈：超纯水=25：75（含0.05%（v/v）TFA，0.1%（v/v）三乙胺），流速：0.5mL·min-1；检测波长：228nm；柱温：30℃；进样量：20µL。（三）结果计算HHL在ACE的催化下快速地分解产生马尿酸(Hip)和二肽（His-Leu，HL），马尿酸在228nm处有最大吸收。当加入ACEI样品时，ACE酶的活性受到抑制，马尿酸生成量减少，所以可通过高效液相色谱测定马尿酸的生成量来评估ACEI对ACE活性的抑制率。计算公式为：%100ABAR式中：R：ACEI样品对ACE的抑制率（%）A：空白对照组中马尿酸的峰面积B：添加ACEI组中马尿酸的峰面积IC50的定义为在一定条件下抑制ACE酶活性一半时所需要的抑制剂浓度。由于抑制率与制剂浓度之间不是一个线性的关系，因此必须首先绘制抑制剂浓度与抑制率关系的曲线，再从曲线上查出IC50。或者IC50按以下方法获得：（1）以log[ACEI]对log(R/(1-R))作图（应为一直线），得到方程Y=aX+b，Y为log(R/(1-R))（2）计算Y=0时X的值，X取反对数即得IC50。