分子发光—荧光、磷光和化学

分子发光—荧光、磷光和化学发光molecularluminescenceanalysis概论分子荧光和磷光光谱分析法化学发光分析法教学要求•掌握荧光的产生、荧光效率及其影响因素；重点掌握溶液强度与溶液浓度的关系及定量分析方法；弄清荧光分析仪器的主要部件及与分子吸收仪器的主要区别。了解磷光分析法及化学发光分析法。•重点：荧光效率及影响因素；溶液强度与溶液浓度的关系及定量分析方法；•难点：荧光的产生，影响荧光效率的因素概述•一、分子发光的类型•荧光Fluorescence•磷光Phosphorescence•化学发光Chemiluminescence光致发光特点：1)灵敏度高（1-100ppb)：有的可达0.01ppb。比吸收光度法高2-3个数量级。WHY??2)选择性好3)方法简单快速，用样量少4)应用不太广泛。分子荧光与磷光光谱分析法molecularfluorescenceandphosphorescence•荧光：•16世纪：在矿物和植物提取液中发现荧光；•1575年：Monardes——植物愈创木切片黄色水溶液——天兰色荧光；•1852年：Stokes阐明荧光发射机制（分光计观测奎宁和叶绿素的荧光，发现波长稍长于入射光的波长——认识到荧光为“重新发光”而不是漫射光；•1905年：Wood发现气体分子的共振荧光；•1926年:Gaviola直接测定了荧光寿命；•1923年：荧光X射线光谱；•1964年：原子荧光光谱分析的建立；•1965年：荧光分析在生物分析中广泛应用；•磷光：•15世纪被发现（重晶石在强烈阳光下的发光）•1944年：Lewis提出磷光用于分析的可能性；•1957年：Keirs将磷光分析用于定量分析及多组份混合物分析；•1963年：广泛用于血液及尿液中痕量药物及农药残留量分析；•一、荧光和磷光的产生•luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence•1.分子能级与跃迁•分子能级比原子能级复杂；•在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；•基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；•激发态→基态：多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度：M=2S+1平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态（tripletstate）能级比相应单重态（singletstate）能级低；激发单重态：分子吸收能量，电子自旋仍然配对，为单重态，称为激发单重态，以S1，S2…表示激发三重态：分子吸收能量，电子自旋不再配对，为三重态，称为激发三重态，以T1，T2….表示。大多数有机分子的基态处于单重态，电子自旋配对，多重度=2s+1=1，为单重态，以S0表示。S0→T1禁阻跃迁单重态基态S0吸收辐射通常自旋不变激发态S1/S2单重态基态S0吸收辐射自旋改变激发态T1/T2规则Hund平行自旋能量更低泡利不相容原理S=12121M=2S+13三重态tripletstate激发后S/T两态激发态单重态与三重态Mg的基态与第一激发态基态1st激发态3s3p12121212121221SJnL2S+1=12S+1=12S+1=3内量子数J有2S+1个取值(L+S),(L+S-1),…,(|L-S|)L=0(用S表示)1(用P表示)1J=012,1,0103S113P313P303P323P光谱项21SJnL改变自旋/禁阻/磷光3p3.激发态→基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量（去活化）传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫能量传递过程（1）振动弛豫（VibrationalRelaxation,VR）在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。（2）内转换（InternalConversion，IC）对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。（3）外转换（ExternalConversion，EC）受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”。•（4）系间跨跃（IntersystemConversion，ISC）•系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间跨跃。•（5）荧光发射•分子电子从单重激发态（Kasha规则）的最低振动能级在很短时间（10-9-10-6s）跃迁到基态各振动能层时所产生的光子辐射称为荧光。由于各种去活化过程的存在，荧光辐射能通常要比激发能量低，或者说，荧光波长大于激发波长（Stokes效应）。•（7）磷光发射•从单重态到三重态分子间发生系间跨跃跃迁后，再经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在10-4-10s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。在光照停止后，磷光仍可持续一段时间。0S）（1T）（1T1S磷光发射低振动能层振动驰豫高振动能层系间窜跃（8）延迟荧光通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。去活化演示ee吸收驰豫eeS0S0S2S1去活化演示e内部转换e荧光e荧光的产生过程荧光的产生eeee吸收激发振动驰豫内部转换S1最低振动能级荧光辐射S0各振动能级二、荧光、磷光与化学结构的关系•1.荧光量子产率•荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示•或••在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移，系间跨跃和外转移等。很明显，荧光的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。吸收的光量子数发射的光量子数激发分子总数发射荧光的分子数kf:应光发射过程的速率常数。可见，凡是使kf增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。通常，kf由分子结构决定（内因），而其它参数则由化学环境和结构共同决定。分析应用价值：量子产率0.1。2.荧光、磷光与有机化合物结构的关系（1）跃迁类型：通常，具有—*及n—*跃迁结构的分子才会产生荧光。而且—*跃迁的量子效率比n—*跃迁的要大得多（前者大、寿命短、kISC小）。iffPECZSCZCVRffkkkkkkkkkk2.荧光、磷光和有机化合物分子结构的关系•（1）.跃迁类型：通常，具有—*及n—*跃迁结构的分子才会产生荧光。而且—*跃迁的量子效率比n—*跃迁的要大得多（前者大、寿命短、kISC小）。•π→π*跃迁自旋许可跃迁，有利于荧光发射•n→π*跃迁自旋禁阻跃迁，有利于磷光发射（2）.共轭体系：共轭度越大，分子的荧光效率越大，且荧光光谱向长波方向移动。增大共轭萘φf=0.29，λf=310nm蒽φf=0.46，λf=400nm在多烯结构中，ph（CH=CH）3ph和ph（CH=CH）2ph在苯中的荧光效率分别为0.68和0.28。绝大多数能发荧光的物质为含芳香环或杂环的化合物。（3）.平面刚性结构：分子刚性（Rigidity）越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。（4）.取代基•给电子取代基增强荧光（p-共轭），荧光波长红移，如-OH、-OR、-NH2、-CN、NR2等；•吸电子基降低荧光，而使磷光加强，如-COOH、•-C=O、-NO2、-NO、-X等；•重原子降低荧光但增强磷光，如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。有利因素增大共轭刚性结构给电子基团不含杂原子3.无机化合物的荧光•（1）螯合物中配位体的发光•不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。•如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。•（2）螯合物中金属离子的特征荧光•这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd跃迁和ff跃迁，最终发射的是dd跃迁和•ff跃迁光谱。三、影响光致发光的因素1.荧光强度与溶液浓度的关系)lg(0IIAAII100)1()101()(303.2000kbcfAffaffeIIIIIIxxxxex1...!3!2132泰勒级数展开002.302.30fffIIAIkbcKc常A0.05fIKc000.10.20.3AIfIf与A的关系A与c正比，低浓度•（1）溶剂对荧光强度的影响：•溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变—*及•n—*跃迁的能量），并使荧光峰发生移动。•与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度，并使荧光峰发生移动。•（2）温度：温度上升使荧光强度下降。其中一个原因是分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。•因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。2.影响荧光强度的因素•（3）pH值的影响：带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH有关。不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有所不同，因此，它们的荧光强度和荧光光谱就有一定的差别。•对于金属离子与有机试剂形成的发光螯合物，一方面pH会影响螯合物的形成，另一方面还会影响螯合物的组成，因而影响它们的荧光性质。（4）荧光的熄灭（猝灭）效应荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光熄灭。能引起荧光强度降低的物质称为熄灭剂（猝灭剂）。碰撞猝灭及能量转移：主要/外部转换热效应溶剂或溶质分子间发生物理或化学作用导致荧光强度下降。与熄灭剂碰撞：M*+Q→M+Q+热激发熄灭剂：M*+Q→M+Q*氧熄灭：顺磁性氧分子，促系间跨跃成三重态。尤其对无取代基的芳香族化合物的荧光影响较为显著。溶剂粘度大↓温度高↑自熄灭/自吸收自熄：浓度高时，激发态之间相互碰撞自吸：荧光曲线与吸收曲线重叠时，被基态分子吸收低浓度！四、荧光和磷光的分析仪器（一）荧光光度计光源单色器1样品池单色器2检测器放大与记录垂直方向与分光光度计的主要差别①垂直测量方式,消除透射光影响②两个单色器，激发和发射，常用光栅光源：常用氙灯、高压汞灯和激光光源。要求：强度大、使用波长范围宽试样室：四面光石英池固体试样架四面光比色皿•（二）激发光谱和荧光、磷光光谱•excitationspectrumandfluorescence（phosphorescence）spectrum•1.荧光(磷光)的激发光谱曲线λEx•固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。•激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大色散系统：光栅第一