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良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程要经过很多步骤和环节，而每一个步骤环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事，这需要病理技术人员和病理医师的密切配合、相互协调、共同努力才能完成。虽然免疫组化染色可以存在各种问题，但从染色结果看一般可分为两类：无色片(无阳性信号)和“杂音”染色片(有阳性信号)。l无色片即染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，有两种可能。1．1真阴性结果整个染色过程没有出现问题，组织或细胞中与抗体相关的抗原确实不表达。1．2假阴性结果即此阴性结果不是真实的反映。1．2．1切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，可能是病理医师对切片或抗体的选择错误。或是技术员选错蜡块，所以获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。故制作出合格的免疫组化切片不仅是技术员的事，病理医师也起着不可或缺的作用。1．2．2染色过程中的某一或某些环节出了问题。如：①组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；②抗体选用不当，选用了只能用于冷冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；③一抗失效。虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也会遇到突然失效的情况，抗体长期不用和／或已超过有效期是主要原因；④染色过程中漏掉了某一环节。如忘记加二抗或三抗。或用了两次二抗而缺少三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。有一种简单的方法可避免这种错误，在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上。再将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上。观察是否出现棕色。如果出现则证明三抗和DAB的配制过程没有错误；如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以旆；如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗或DAB及其配制过程。这种方法能迅速地帮助我们找出问题的原因；⑤抗体未完全覆盖测试组织，当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织。解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所用试剂均没有问题。此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照也没有着色，表明染色过程中的某个或某些步骤出了问题。或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种：一种称为自身对照或内部对照。这是指在测试的切片中存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原。CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照。对照和要测试的组织、细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时，最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为外部对照。有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑存在恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart—l来检测，而正常胃组织本身不存在相关抗原，如果病变出现阳性反应结果，就能提示是恶黑，但如果出现阴性结果。就无法确定是组织自身不合黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为外部对照。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前，国内、外均有单位将多种不同组织集合在一起，制成多组织切片、“腊肠”、“春卷”切片、组织芯片等，将其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法是采用阑尾切片作为阳性对照，因为与人体其他组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，含有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管和间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。设立阳性对照是病理医师的工作或责任，而不是技术员的责任。病理医师观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应该告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医师在免疫组化检测中的作用不可忽视。2“杂音”染色片免疫组化除正常的、真实的阳性信号外常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，将其归纳为下面几种。2．1全片着色全片着色是指整个切片全部染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清哪些组织是阳性哪些是阴性(图1)。出现这种现象有几种原因。2．1．1抗体浓度过高一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找出适合自己实验室的理想工作浓度，即使是即用型的抗体也应如此，不能只简单地按说明书进行染色。2．1．2抗体孵育时间过长或温度较高解决办法是严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法(polymer)敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1h，而是30min，因此，要根据染色结果进行调整。2．1．3DAB变质和显色时间过长DAB最好现用现配，如有沉渣应过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间过长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应，而降低DAB的效力。未用完的DAB存放在冰箱中几天后再用，这种看似节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。当染色片太多时，或用染色机时，至少应对一些新的或少用的抗体显色时间进行监控，避免显色时间过长。2．1．4组织变干修复液溢出后未及时补充、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO(或PAPPen)笔在组织周围画圈，可以有效避免液体流失，也可提高操作速度。2．1，5切片在缓冲液或修复液中浸泡时间过长(24h)有些实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色。如果将装有切片和修复液的容器放在4℃冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温下，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。2，1．6一抗变质和质量差的多克隆抗体注意抗体的有效期，过期的抗体容易不显色或背景着色。用新购的抗体时最好设立阳性对照或用已用过的抗体作比较。2．2切片边缘着色切片边缘着色也是一种常见现象，这种现象称为边缘效应。产生的原因有几种。2．2．1组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面的试剂洗净所致。解决的办法：制备优质的胶片(APES或多聚赖氨酸)，切出尽量薄的组织切片(4pan)，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。2．2．2切片上滴加的试剂未充分覆盖组织时，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决的办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2Illin。用DAKO笔画圈时，为了避免油剂的影响．应距组织边缘3～4Illin画圈。2．3“阴阳脸”着色指组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。其原因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部，如试剂未流散开而集中在部分组织上。通常应该在加完试剂后仔细看一遍，是否有的组织未被试剂完全覆盖，如有这种情况，建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引开使之将组织全部覆盖。另外，如染片盒不平或切片倾斜，虽然起初试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边造成部分组织未被覆盖。对于这种问题，只要留心就容易发现并解决。有时，用DAKO(或PAP)笔在组织周围画圈时，画线太靠近或画到了组织上，由于笔油的力学原理，试剂不能达到靠近画线附近的组织；还有气泡也可造成阴阳分明的着色(不着色区域呈圆形)，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此气泡中心的组织不着色。解决的办法：滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破(图2)。2．4灶片状着色切片中着色区呈灶片状分布，出现这种问题的原因如下。2．4．1裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗净，显色过深所致(图3)。解决的办法：漂片盒里的气泡应除尽，晾片热台不能平放，应有45。左右的斜度，利于水分流走和蒸发。2．4．2坏死组织灶。组织坏死后细胞破坏、酶释放，蛋白游离、分解，复杂的肽链残段(如Fc段)可能与一抗和／或二抗结合导致最终着色。解决的办法：在选择染色切片时，应避免选择坏死组织较多的切片。2．4．3制作APES胶片时胶的浓度太高，干燥后在玻片上留下白色小点，显色时白色小点着色。解决的办法：按照标准的制备方法进行，即5％盐酸乙醇(盐酸5Ⅱl+95％乙醇95ha)浸泡玻片4h，热水冲洗玻片1h，蒸馏水洗玻片1min，丙酮浸泡玻片5s后空气干燥(室温)，2％(2mlAPES+98nIl丙酮)浸泡玻片5min，玻片过一下丙酮(1～2s)，玻片过一下蒸馏水(1～2s)，37℃过夜干燥，室温储存备用。如果制片过程中，因丙酮逐渐挥发而胶变浓时可适当加入一些丙酮。2．5间质着色着色部位主要在间质，其原因很多，如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色(加一抗前的血清封闭步骤就是为了避免非特异性结合)；又如血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质，很容易与抗体结合，造成间质着色，特别是在Lambda和Kappa染色时。当甲状腺胶质外溢到组织间质时，甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色；抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色。我们曾遇到因CD20抗体不纯，除B细胞外间质也染上了色。2．6细胞质着色胞质着色是所有“杂音”染色中最具有欺骗性的着色，着色区局限在细胞内，问质无着色，看上去与真实的免疫反应着色几乎一样，很难区别。胞质中含有较多的蛋白质，因此，很多非特异性的染色除了间质也可以出现在胞质中。这种原因造成的着色，可以通过血清封闭解决。还有因内源酶造成的着色，如血红蛋白(红细胞)、肌红蛋白(肌细胞)、细胞色素(粒细胞、单核细胞)、过氧化氢酶(肝、肾)，这些可用过氧化氢进行封闭。巨噬细胞吞噬各种抗原物质或Fc片断而出现胞质着色，这种着色不易避免，但可以通过形态学辨认出巨噬细胞而引起重视。内源性生物素的着色最具有欺骗性，因为它广泛存在于组织细胞中，我们的研究结果显示，冷冻组织中存在内源性生物素，经甲醛固定、石蜡包埋后，生物素被封闭，在加热抗原修复后造成内源性生物素暴露2。内源性生物素暴露的强度在不同的组织中有所不同，从弱阳性到强阳性，其在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞质中，还广泛存在于上皮源性组织，特别是腺上皮组织，亦存在于部分非上皮组织。内源性生物素不仅存在于人体组织也存在于大鼠组织，其暴露的强弱与修复液有关，其强度增加依次为柠檬酸、EDTA、EGTA。热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭，非生物素检测系统Polymer两步法(EliVisi0n、EnVision)可避免生物素干扰(图4)。2．7细胞核着色不适当的组织处理可以出现细胞核着色，例如组织在二甲苯中浸泡时间过长(如从星期五浸泡到下星期一)；在缓冲液中浸泡时间过长；组织变干；微波修复液的pn值和修复时间不当或修复过程中修复液太少而未没过组织等。解决办法是严格按照操作常规进行工作。