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产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1.掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2.巩固十倍稀释法。二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。三、实验材料1.菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2.土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3.培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。3．涂布平板分离①倒平板将淀粉琼脂培养基融化后倒平板（12个），每平板约15ml。（注意平皿中的培养基厚度要均匀）②土壤稀释液的制备取富集培养液1mL，放入盛9mL无菌水的试管中，充分振匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7和10-8几种稀释度的土壤溶液。③涂布将上述培养基的平板底部用记号笔分别写上10-5，10-6，10-7和10-8四种稀释度字样，每种培养基每种稀释度标记3皿，然后用移液枪分别由10-5，10-6，10-7和10-8四种土样稀释液中吸取0.1ml菌液放入写好稀释度的平板中央位置，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻地涂满整个平面，室温下静置5-10min。④培养将平板倒置在37℃温箱中培养48h。4.检测观察细菌的生长情况，打开平板盖子，加入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液铺满整个平板，观察是否有水解圈的产生。5．产淀粉酶菌株的纯化①倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板（12个），每平板约15mL（注意平皿中的培养基厚度要均匀）②平板划线选择在10-5，10-6，10-7和10-8四个稀释度下，每组淀粉琼脂培养基中产生透明圈最大的1个菌落，用无菌水将碘液冲洗掉，挑取远离透明圈的少许菌苔，在3个牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线接种。③培养将平板倒置在37℃温箱中培养48h。6．鉴定保存观察细菌的生长情况，打开平板盖子，加入少量卢戈氏碘液于平板种，轻轻旋转平板，使碘液铺满整个平板。观察能产生透明圈的菌落特征，进行初步鉴定，并接种到牛肉膏斜面上保存。五、技术路线样品采集富集培养（110r/min，37℃，24h）倒平板（淀粉琼脂培养基12个）土壤稀释液制备涂布培养（37℃，48h）加碘液（观察是否有淀粉水解圈产生）倒平板（牛肉膏蛋白胨培养基12个）平板划线（选取在淀粉琼脂培养基中产生透明圈最大的菌落）培养（37℃，48h）鉴定保存（观察可产生水解圈的菌落的特征）