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SpectrumLivingImage4.0软件操作流程本流程主要介绍Spectrum的LivingImage4.0软件的应用，包括参数介绍、生物发光、荧光二维及三维成像的图像获取及数据分析1、控制面板参数介绍整个图像的获取过程都通过该控制面板操作，其中曝光时间、bin值及光圈大小是最为关键的参数，直接影响图像获取的质量。曝光时间（exposuretime）曝光时间决定了信号强度，曝光时间越长，信号强度越高，实验时应根据实际情况设定适当的曝光时间，初次实验若不知道合适曝光时间，可选择Auto曝光，仪器会自动检测一个合适的曝光时间以成像，当信号较弱时可适当增加曝光时间以获取较佳信号。注：生物发光成像的曝光时间为分钟（min）级别，而荧光成像的曝光时间为秒（sec）级别，实验时应注意参数设定。关键参数，决定灵敏度Bin值（Binning）Bin值表述的是将多少像素作为感光单元，bin值越大则表示应用更多的像素作为一个感光单元，因此，bin值越大则灵敏度越高，而分辨率会有所牺牲，当信号强度较弱时可适当增加bin值以获取信号。光圈大小（f/stop）光圈大小决定了光的透过量，光圈越大，穿过光圈到达CCD的光越多，面板中的数字为F/stop中的分母数字，因此，数字越小代表光圈孔径越大，透过的光越多，当信号较弱时可通过增大光圈（减小数字）而增强信号探测能力。f/1f/8LargeBinning(16)MediumBinning(8)SmallBinning(4)视野范围（FiledofView）视野范围用于调节观测的视野大小，共有A/B/C/D四档可选，分别代表不同大小的视野范围，实验时根据一次观察小鼠个数选择合适的视野范围进行成像。成像聚焦（Focus）成像的聚焦包含自动聚焦和手动聚焦功能，在用小鼠进行成像时，一般默认成像对象的高度为1.5cm，仪器会自动完成聚焦，在用其他对象进行成像时（如大鼠），可调节Subjectheight参数，设定合适的聚焦高度，也可在Focus下拉选项中选择聚焦设定FOVA:4.0cmFOVB:6.5cmFOVC:12.5cmFOVD:21.5cm2、生物发光二维成像的图像获取勾选Luminescent、Photograph及overlay选项，设置好曝光时间（生物发光曝光时间为分钟级别）、bin值、光圈大小及视野范围等参数（软件有默认参数，可按照默认参数成像，若效果不佳，则再调整各参数，调整的次序按照曝光时间＞bin值＞光圈大小顺序调整），EmissionFilter选项设置为open，Photograph选项的参数一般情况无需调整，所有参数设定完毕后点击Acquire按钮即可开始成像。成像完成后，在得到结果图的同时会弹出实验信息记录对话框（下图右框），可输入相关实验信息以记录实验情况，一次可最多同时选择5个选项进行记录，记录完成后，记录的相关信息会反映在结果图中，点击结果图中的info按钮即可看见。3、荧光二维成像的图像获取荧光二维成像与生物发光二维成像的操作流程基本类似，只是多了一些参数的设定，另外，对于需要扣除背景的成像，需应用到荧光光谱分离技术，该技术的操作流程将在第4节中详细说明，本节主要介绍获取单张荧光二维图片的操作流程。荧光二维成像可选择使用反射照明或透射照明进行荧光激发，当信号在皮下等较浅部位时可选择反射照明成像，而当信号位于肝脏等较深部位时可选择透射照明（Transillumination）进行成像。对于反射照明成像具体步骤如下：勾选Fluorescent、Photograph及overlay选项，设置好曝光时间（荧光曝光时间为秒级别）、bin值、光圈大小及视野范围等参数（软件有默认参数，可按照默认参数成像，若效果不佳，则再调整各参数，调整的次序按照曝光时间＞bin值＞光圈大小顺序调整），根据标记所用探针的激发光及发射光波长，选择合适的激发光（Excitation）及发射光（Emission）滤片，Photograph选项的参数一般情况无需调整，所有参数设定完毕后点击Acquire按钮即可开始成像。对于透射照明成像，其他步骤与反射照明成像相同，只是需要选择Transillumination选项，点击Setup按钮进行透射点的选择，对于单张图片的获取只需选择一个点。选择荧光成像模式选择滤光片透射照明绿色代表点已选上4、荧光光谱分离SpectralUnmixing是一种将背景荧光信号与荧光探针信号分离的光谱分离方法。其应用主要包括两方面：1、将特异性荧光信号从组织自发荧光中分离出来；2、将不同的探针信号分开，用于多种探针同时成像。这里以反射荧光成像为例，详细介绍应用LivingImage4.0进行SpectralUnmixing的具体步骤。更详细的说明请参见UserGuide。点击SequenceSetup按钮，进行序列图的成像设定，可点击Add按钮手动添加并设定多图成像参数，但这样比较复杂，目前的软件都已具有ImagingWizard功能，该功能相当于一个参数设定向导，可引导使用者进行包括unmixing在内的多种功能的完成（如下图）：选择Fluorescence选项，按照向导指示完成unmixing设定操作（如下）：选择Spectrumunmixing选择探针类型，如果所用探针下拉列表中包含则直接选择该探针，如果列表中没有则在下拉列表最下方有InputEX/EM,可自行输入探针的激发光和发射光波长3种波长扫描获取方式，通常使用发射光扫描方式(EmissionScan)，即固定激发光波长，选择不同发射光波长成像选定探针后，软件会自动给出相应的光谱图，蓝色虚框圈选的即为将扫描的波段生物发光成像荧光成像点击ImagingWizard按钮，进入设置向导根据实验对象，选择正确的Subject其他参数设定与控制面板中参数设定相同点击Next按钮后，设定好的序列图参数会自动显示在下图中，Unmixing将基于这些图片的获取而进行点击AcquireSequence按钮，将开始序列图的获取，结果如下获取的原始序列图，将基于这些序列图进行光谱分离在图像分析工具栏中点击展开SpectralUnmixing工具条，选择进行光谱分离的波长，点击StartUnmixing按钮选择需要进行光谱分离的区域，可通过滑动条改变区域大小，紫色表示已选定区域，通常使用软件默认选择的紫色区域即可显示光谱分离2种成分，分别是探针信号和组织自发荧光信号显示光谱分离结果，左上图为分离得到的背景光信号，右上图为分离得到的特异性探针信号，左下图为用两种假色表示的合成图，发表文章需要的为右上图的探针信号图，后续的定性定量分析均选择此图进行，双击此图后便可开始后续分析，分析操作将在下列章节介绍选择需要进行光谱分离的成分点击左图中的Spectra按钮，可显示线性光谱图，详细显示背景光谱图及探针信号光谱图5、二维结果定量分析活体可见光系统测定的二维信号均为体表发出的信号值，对于信号的定量均使用工具栏中的ROITools定量分析工具条，下面介绍如何应用ROI进行定量分析。点击展开ROITools工具条，定量所有操作均在此工具条中完成共有4中ROI圈选方式对信号进行圈选定量，点击每种圈选方式下拉列表，都可选择一定数量的ROI（如右上图同时圈选2个ROI），也可选择Auto，让软件根据信号自动绘制ROI，还可选择FreeDraw自行绘制ROI，一般以圆圈绘制ROI比较多，另外，利用栅格图形可对微孔板进行ROI圈选，有多种微孔板类型可选择（右下图）ROI圈选完成后点击如左上图所示的Measurement按钮，定量数据将会出现在右图中的ROI上方，同时会给出右上图所示的定量数据表数据表中数据可选定后直接copy至excel表中，进行后续的统计学分析，也可点击Export按钮，以txt文本形式将数据输出保存，点击Configure按钮，可选择添加或删除显示在数据表中的选项ROI定量的单位可在Units中选择，通常有Counts和Radiance（Photons）两种单位，通常选择Radiance（p/sec/cm2/sr）这个单位作为定量单位，反应的是单位弧度、单位面积、单位时间从体表发出的光子数，这个定量单位是不随拍摄参数（如曝光时间等）的改变而改变的，因此准确度和可信度非常高，可以满足用户进行不同时间、不同拍摄参数、不同仪器间所得的定量数据的比较。在Display选项中，可选择不同的图像显示模式，如选择Overlay，即表示所显示图像为明场信号和暗场信号的叠加图，如只选择Photograph，则在结果图中将只显示明场老鼠图，而不显示生物发光或荧光信号。在定量分析的时候，有时涉及到不同老鼠间同一部位的信号ROI定量分析或者不同时间点同一只老鼠同一位置的信号ROI定量分析，这些情况需要保证ROI圈选大小的一致性，有如下方式保证ROI圈选的一致：1、将鼠标移至圈线上，单击鼠标右键将出现上图蓝色框中的对话框，可以copy已有ROI，然后粘贴至其他信号处即可保证ROI一致；2、将鼠标移至圈线上，双击鼠标左键将出现上图紫色框中的对话框，在其中绿色框中可以数字形式设置ROI的精确大小，之后每个ROI都可按同样的数值设定；3、在一个图上圈定ROI后，可在工具条中保存ROI的圈选（如右图），之后可在打开其它拍摄图后在同样的位置Load已保存的ROI，即可保证ROI的一致。信号的强弱以左图中的假色条表示，如图中的假色条，蓝色表示信号弱，红色表示信号强，假色条上均有数值标尺，下方显示定量单位及数值上下限6、生物发光及荧光三维成像生物发光及荧光三维成像均是基于不同波长光的光谱特性而进行的，因此操作时均需进行多个波长的多图成像。无论是生物发光还是荧光，在对光信号进行三维重组之前，均需进行小鼠体表的表面拓扑成像，之后再进行光信号的三维重组，以下分为几个步骤来介绍三维成像的操作流程：6.1利用ImagingWizard进行三维成像序列图的设定如同SpectrumUnmixing一样，对于三维成像的多个波长的序列图设定我们依然借助Wizard向导进行设置，步骤如下：点击ImagingWizard按钮，进入设置向导进行生物发光三维成像点击Bioluminescence，并选择下图红框所示的DLIT进行荧光三维成像点击Fluorescence，并选择下图红框所示的FLIT选择标记所用探针探针选定后，软件会自动给出对应波长，对于生物发光成像，软件会自动给出要进行成像的波段，如左上图虚框所圈波段，对于荧光成像，还需在下面步骤选择透射点以进行多图成像对于生物发光成像，在下图界面设置好其他相应参数后，点击Next即可对于荧光成像，在下图界面设置好其他相应参数后，点击TransilluminationSetup后，进行透射点的选择对于生物发光，点击Next之后，序列图将呈现在下图中根据二维成像结果，选择需要进行透射成像的点，绿色代表点已选上，选择完毕后，所设置序列图将在下图中显示序列图设置完毕后，点击AcquireSequence按钮，软件将自动开始序列图的获取6.2进行表面拓扑成像重建图像获取完成之后，接下来首先要进行所拍摄小鼠体表的表面拓扑图像绘制，即获取小鼠的轮廓结构，具体操作如下：序列图获取完毕后，各单张结果将显示在如下所示的对话框中，左图为生物发光，右图为荧光，接下来将进行表面拓扑成像以及信号的三维重建在工具栏中，点击展开SurfaceTopography工具条（红框所示），通过Subject下拉列表选择实验拍摄对象，通过Orientation下拉列表选择小鼠放置的体态（Dorsal表示背部朝上，Ventral表示腹部朝上），选择完成后点击Reconstruct，将出现左下图所示，要求用户选择需要进行表面拓扑成像的区域（通过绿色选框选取），然后点击Next按钮，将会出现一个对话框（右下图）表示出已选好的区域（紫色表示），可通过滑动条来选取制定区域，点击Finish按钮，软件即可自动完成表面拓扑结构的绘制。表面拓扑结果图6.3生物发光信号三维重建点击展开DLIT3DRecon