组织糖胺多糖(GAG)总含量阿尔新蓝(alcianblue)比色法

1组织糖胺多糖（GAG）总含量阿尔新蓝（alcianblue）比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途组织糖胺多糖（GAG）总含量阿尔新蓝（alcianblue）比色法定量检测试剂是一种旨在通过高盐萃取可溶性糖胺多糖，与阿尔新蓝染料结合，在丙醇解离溶液中，释放蓝色染料，由分光光度仪比色分析，定量检测组织样品中糖胺多糖含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种人体或动物组织（皮肤、肌肉等）、软骨、结缔组织、肿瘤组织等样品糖胺多糖水平检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测准确。技术背景糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG），又称为粘多糖（mucopolysaccharide），是体内最为丰富的异源多聚糖。糖胺多糖是一种未分叉的负电荷性长链多聚糖，由重复的二糖单位，包括六碳糖（hexose）或己糖醛酸（hexuronicacid），链接到己糖胺（hexoamine）上而成。糖胺多糖与核心蛋白（coreprotein）共价相联，构成蛋白多糖（proteoglycan；PG），成为细胞膜和细胞外基质（extracellularmatrix；ECM）的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成过程中发生硫酸酯化（sulfatedgroup），其部位在O或N位上，有利于发挥各种不同的作用，包括酶的调节、细胞黏附、生长、迁移、分化，以及组织损伤反应。基于糖胺多糖的高度负电荷的特点，使用异染性（metachromatic）四价（tetravalent）阳离子蓝色染料阿尔新蓝（alcianblue），在酸性条件下，特异性的结合产生不溶性蓝色糖胺多糖染料复合物（Dye-GAGcomplex），在丙醇解离溶液中，释放出染料，通过分光光度仪（600nm波长）测定，来定量分析糖胺多糖的总含量。产品内容萃取液（ReagentA）12毫升高盐液（ReagentB）1.5毫升酸性液（ReagentC）10毫升染色液（ReagentD）1.5毫升清理液（ReagentE）25毫升解离液（ReagentF）25毫升标准液（ReagentG）100微升产品说明书1份保存方式保存在4℃冰箱里；染色液（ReagentD）避免光照；试剂具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证3月用户自备无离子水：用于配制工作液1.5毫升离心管：用于样品操作的容器微型台式离心机：用于样品操作2比色皿或96孔板：用于比色分析的容器分光光度仪或酶标仪：用于比色分析实验步骤一、样品预处理1．手术取出动物组织，并秤重以确定200毫克组织重量2．移入到一个液氮冻存管3．即刻放进液氮罐过夜4．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）5．放进一个1.5毫升离心管6．加入500微升萃取液（ReagentA）7．强力涡旋震荡1分钟，充分混匀8．放进4℃冰箱里孵育16小时，期间涡旋震荡1分钟五次9．放进微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf5415）10．小心移取上清液到新的1.5毫升离心管11．置于冰槽里备用二、标准样品配制1．准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管2．分别加入50微升萃取液（ReagentA）到1至5号管3．移取50微升标准液（ReagentG）到1号管，混匀4．小心移取50微升1号管稀释的标准液（ReagentG）到2号管，混匀5．小心移取50微升2号管稀释的标准液（ReagentG）到3号管，混匀6．小心移取50微升3号管稀释的标准液（ReagentG）到4号管，混匀7．将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表管号萃取液（ReagentA）标准液（ReagentG）标准糖胺多糖含量150微升50微升20微克250微升50微升1号管10微克350微升50微升2号管5微克450微升50微升3号管2.5微克550微升00三、标准曲线测定检测开始前，移取1.25毫升酸性液（ReagentC）到15毫升锥形离心管，加入2.25毫升用户自备的无离子水，混匀，然后加入0.25毫升染色液（ReagentD），混匀后，标记为染色工作液（共5次检测），置于暗室里备用。然后进行下列操作。1．移取50微升上述配制的标准液（ReagentG）到1.5毫升离心管2．加入50微升高盐液（ReagentB），混匀33．室温下孵育15分钟4．加入50微升酸性液（ReagentC），混匀5．室温下孵育15分钟6．加入750微升染色工作液7．涡旋震荡15秒8．室温下孵育15分钟，避免光照9．即刻放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g10．小心抽去上清液（注意：确保没有水滴残留）11．加入1毫升清理液（ReagentE）12．涡旋震荡15秒（注意：确保重悬颗粒）13．放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g14．小心抽去上清液（注意：确保没有水滴残留）15．加入1毫升解离液（ReagentF）16．涡旋震荡15秒17．室温下孵育15分钟，避免光照（注意：确保充分溶解）18．转移到新的比色皿19．即刻放进分光光度仪检测（波长600nm）：获得标准样品吸光读数20．重复实验步骤1至19四次21．构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数；横座标（X轴）为标准糖胺多糖含量（微克）四、样品测定1．加入50微升上述制备的待测样品到1.5毫升离心管2．加入50微升高盐液（ReagentB），混匀3．室温下孵育15分钟4．加入50微升酸性液（ReagentC），混匀5．室温下孵育15分钟6．加入750微升染色工作液7．涡旋震荡15秒8．室温下孵育15分钟，避免光照9．即刻放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g10．小心抽去上清液（注意：确保没有水滴残留）11．加入1毫升清理液（ReagentE）12．涡旋震荡15秒（注意：确保重悬颗粒）13．放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g14．小心抽去上清液（注意：确保没有水滴残留）15．加入1毫升解离液（ReagentF）16．涡旋震荡15秒17．室温下孵育15分钟，避免光照（注意：确保充分溶解）18．转移到新的比色皿19．即刻放进分光光度仪检测（波长600nm）：获得样品吸光读数20．根据上述标准曲线获得样品对应糖胺多糖含量（微克）五、浓度计算4【根据上述标准曲线样品对应糖胺多糖含量（微克）X样品稀释倍数】÷0.050（样品容量；毫升）＝微克糖胺多糖/毫升注意事项1．本产品为25次操作，包括标准样品2．本产品不适合于非硫酸酯化的二糖降解片段、透明质酸（hyaluronate）的检测3．本产品可以检测硫酸软骨素（chondroitinsulfate）、硫酸角质素（keratansulfate）、硫酸皮肤素（dermatansulfate）、硫酸类肝素（heparansulfate）等主要糖胺多糖4．本产品检测范围为0.5至20微克糖胺多糖5．操作时，须戴手套6．试剂具有腐蚀性，注意操作安全7．系统操作时，标准样品测定只需1次8．空白对照读数通常小于0.2，如果超过表明抽去上清操作不当9．孵育时，避免光照10．如果样品糖胺多糖含量过低，可以浓缩样品或增加样品量至100微升11．样品浓度可以表述为：微克糖胺多糖/组织重量；微克糖胺多糖/组织总蛋白等12．本公司提供系列糖类代谢检测试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感