超滤管使用指南

1Amicon®Ultra-15离心过滤器中文引言Amicon®Ultra-15离心过滤器具有快速超过滤功能，能够达到较高的浓缩系数，易于从稀释液和复杂的样本组合进行浓缩液回收。其竖式设计以及可用的滤膜表面积能提供快速的样本处理和较高的样本回收率（通常大于90%稀薄的初始溶液），并能进行80倍浓缩。典型的处理时间为15至60分钟，这取决于标称分子量限值（NMWL）。竖式设计将溶质极化和之后造成的滤膜结垢降至最低，过滤装置中的物理止滤点防止过滤器旋转过度使样本干燥和造成样本损失。浓缩液用移液管从过滤器的样本槽中收集，而超过滤滤出液则收集到所提供的离心管中。该装置可在摆桶或定角转子中旋转。Amicon®Ultra-15装置未经消毒，只供一次使用。Amicon®Ultra-15产品系列有5种不同的截留分子量（标称分子量限值，NMWL，或截留分子量，MWCO）：●Amicon®Ultra3K装置—3,000NMWL●Amicon®Ultra10K装置—10,000NMWL●Amicon®Ultra30K装置—30,000NMWL●Amicon®Ultra50K装置—50,000NMWL●Amicon®Ultra100K装置—100,000NMWLAmicon®Ultra-1510K过滤器用于体外诊断，可用来在分析之前浓缩血清、尿液、脑脊髓液和其他体液。Amicon®Ultra-153K,30K,50K和100K过滤器仅用于研究，不用于诊断程序。用户指南Amicon®Ultra-15离心过滤器用于体积不超过15mL的样本Amicon®Ultra-1510K装置，供体外诊断用Amicon®Ultra-153K,30K,50K和100K装置仅用于研究，不用于诊断程序。2Amicon®Ultra-15离心过滤器所提供的材料Amicon®Ultra-15装置包括一个盖子、一个过滤器和一个离心管。过滤器离心管盖子应用●浓缩含有抗原、抗体、酶、核酸（单株或双株DNA/RNA样本）、微生物、洗出液和净化样本的生物样本●净化组织培养基提取液和细胞溶解液中的大分子成分，从反应混合液中去除引物、连接或分子标记，在HPLC之前去除蛋白质●除盐、更换缓冲液或渗滤所需设备●带有摆桶式或定角式转子的离心器以及可以容纳50mL试管的样本腔/试管座注意：为了避免在离心过程中损坏装置，在旋转前请检查间隙。●带有200微升（µL）尖端的移液管，用于浓缩液回收适用性为确保对预定用途的适用性，建议进行初步的回收和截留试验。请参见“如何量化回收”部分。装置储存与保质期储存在15–30°C下。保质期自生产之日起3年。对于产品目录编号为UFC901008、UFC901024和UFC901096的产品，请参见包装标签上的失效日期。3Amicon®Ultra-15离心过滤器预清洗Amicon®Ultra-15装置的超过滤薄膜含有微量甘油。如果此材料干扰分析，可用缓冲液或Milli-Q®水预清洗。如果干扰仍然存在，用0.1NNaOH清洗，然后用缓冲液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。注意：Amicon®Ultra超过滤装置中的滤膜一旦润湿后应避免重新干燥。若在预清洗后没有立即使用该装置，则让液体保留在滤膜上，直到使用该装置为止。如何使用Amicon®Ultra-15离心过滤器1.向Amicon®Ultra超过滤装置加入不超过15mL的样本（如果使用定角转子则为12mL）。2.将盖好盖子的过滤装置放入离心转子中，用一个类似的装置抵住。3.当使用摆桶转子时，以最大4,000×g旋转约15–60分钟。当使用定角转子时，装置的方向要使滤膜面板朝上，以最大5,000×g旋转约15–60分钟。说明：关于典型旋转时间，请参见图1和图2以及表1和表2。4.如要回收浓缩后的溶质，在过滤装置底部插入一个移液管，然后左右摇摆着吸取样本，以确保完全回收。超滤液可以保存在离心管中。说明：要想达到理想回收，离心后请立即取走浓缩后样本。除盐或渗滤除盐、更换缓冲液或渗滤是去除含有生物分子的溶液中的盐分或溶剂的重要方法。可以在Amicon®Ultra-15装置中，通过浓缩样本、然后向浓缩液加入任何所需溶剂复原至样本原始体积的方式，去除盐分或更换缓冲液。可重复“洗出”过程，直到污染微溶质的浓度充分降低为止。请参见下文举例。旋转浓缩旋转浓缩15mL1mg/mL蛋白质100mMNaCl溶液200µL75mg/mL蛋白质100mMNaCl溶液100mMNaCl200µL75mg/mL蛋白质11.2mMNaCl溶液11.2mMNaCl加入14.8mL10mMNaCl或更换缓冲液15mL1mg/mL蛋白质11.2mMNaCl溶液4Amicon®Ultra-15离心过滤器024681012141601020304050603K10K30K50K100K旋转时间（分钟）滤出液体积（mL）图1.典型的滤出液体积与旋转时间（摆桶式转子）旋转条件：4,000×g，室温，15mL起始体积。所使用的蛋白质分子量标准：对3K和10K使用细胞色素c，对30K和50K使用BSA，对100K使用IgG，n=6。滤出液体积（mL）02468101201020304050603K10K30K50K100K旋转时间（分钟）图2.典型的滤出液体积与旋转时间（定角转子）旋转条件：5,000×g，室温，12mL起始体积。所使用的蛋白质分子量标准：对3K和10K使用细胞色素c，对30K和50K使用BSA，对100K使用IgG，n=6。性能流速影响流速的因素包括样本的浓度、起始体积、溶质的化学性质、相对离心力、离心转子的角度、滤膜类型以及温度。图1和图2以及表1和表2可用来估计对各种蛋白质分子量标准达到给定的滤出液体积或浓度所需的时间。15mL样本旋转时间一般约需15至60分钟（取决于装置的标称分子量限值）。尽管大部分样本在离心过程的前15至30分钟滤过，但一般在旋转15至60分钟之后才能达到最低浓缩液体积（150–300µL）。5Amicon®Ultra-15离心过滤器流速，续表1.典型的浓缩液体积与旋转时间（摆桶式转子）浓缩液体积(μL)旋转时间（分钟）3K装置10K装置30K装置50K装置100K装置10–6683612497,42015–––201–20–2192061752,21630537145155–24440331146135–14145299––––60209––––旋转条件：4,000×g，室温，15mL起始体积。所使用的蛋白质分子量标准：对3K和10K使用细胞色素c，对30K和50K使用BSA，对100K使用IgG，n=6（3批滤膜的平均值）。灰色的体积是用来计算表4中蛋白质回收量的体积。表2.典型的浓缩液体积与旋转时间（定角转子）浓缩液体积（µL）旋转时间（分钟）3K装置10K装置30K装置50K装置100K装置10–9944111362,76015–––113–20–2731409140030947159111–1664052910190––45462––––60268––––旋转条件：5,000×g，室温，12mL起始体积。所使用的蛋白质分子量标准：对3K和10K使用细胞色素c，对30K和50K使用BSA，对100K使用IgG，n=6（3批滤膜的平均值）。灰色的体积是用来计算表4中蛋白质回收量的体积。蛋白质截留率和浓缩液回收率Amicon®Ultra超过滤装置滤膜的特征由标称分子量限值（NMWL）描述，即它们截留超过一定分子量的分子的能力。分子量接近NMWL的溶质可能只有部分被截留。滤膜的截留率取决于溶质的分子大小和形状。在大多数应用中，分子量是用来评估截留特性的一个方便的参数。MerckMilliporeLtd.建议在浓缩应用中使用NMWL至少比蛋白质分子量小两倍的滤膜。请参见表3。6Amicon®Ultra-15离心过滤器表3.蛋白质分子量标准的典型截留率分子量标准/浓度分子量装置NMWL截留率%摆桶截留率%定角旋转时间（分钟）α-胰凝乳蛋白酶原(1mg/mL)25,0003K959560细胞色素c(0.25mg/mL)12,400959560维他命B-12(0.2mg/mL)1,350252560α-胰凝乳蛋白酶原(1mg/mL)25,00010K959530细胞色素c(0.25mg/mL)12,400959530维他命B-12(0.2mg/mL)1,3505530BSA(1mg/mL)67,00030K959520卵清蛋白(1mg/mL)45,000959520细胞色素c(0.25mg/mL)12,400101020维他命B-12(0.2mg/mL)1,3505520BSA(1mg/mL)67,00050K909010卵清蛋白(1mg/mL)45,000~65~5510细胞色素c(0.25mg/mL)12,4005510甲状腺球蛋白(0.5mg/mL)677,000100K909020IgG(1mg/mL)156,000909020卵清蛋白(1mg/mL)45,000251520表3和表4的旋转条件：摆桶转子（4,000×g,15mL起始体积），或者定角转子（5,000×g,12mL起始体积），室温，n=6（3批滤膜的平均值）。蛋白质截留率和浓缩液回收率，续决定样本回收率的因素包括相对于所选装置的NMWL的蛋白质溶质的性质、起始浓度和浓缩系数。表4提供了Amicon®Ultra-15装置的典型回收率。表4.典型的浓缩液回收率浓缩液体积（μL）浓缩系数（x）浓缩液回收率（%）分子量标准/浓度装置NMWL旋转时间（分钟）摆桶式定角式摆桶式定角式摆桶式定角式细胞色素c(0.25mg/mL)3K6020926873.844.693.894.4细胞色素c(0.25mg/mL)10K2021927371.444.895.995.1BSA(1mg/mL)30K2020614072.885.596.295.5BSA(1mg/mL)50K1520111377.7106.890.792.0IgG(1mg/mL)100K3024416667.671.981.082.9灰色列取自表1和表2。7Amicon®Ultra-15离心过滤器如何量化回收使用以下方法计算总回收量、浓缩液回收率%及滤出液回收率%。本程序可算出浓度最高约20 mg/mL的溶液的回收量近似值。说明：适当的化验技术包括吸收分光光度学法、放射免疫检定法、折光率及传导性。直接称重程序大多数稀释蛋白的密度与水的密度大致相同(即1g/mL)。利用这一特性，可通过称取浓缩液与滤过液重量并将其单位从克转化成毫升的方法，对其进行量化。本方法仅适用于浓度不超过或约为20mg/mL的溶液。1.使用之前，分别称取空的过滤装置、离心管和空的浓缩液收集管的重量。2.在过滤装置中加入溶液，然后重新称重。3.按说明组装装置和离心机。4.用移液管收集浓缩液，然后将其注入到已经预先称重的浓缩液收集管。5.从离心管上取下装置，然后称取离心管和浓缩液收集管的重量。6.减去空的装置/试管的重量，计算初始材料、滤过液及浓缩液的重量。7.化验初始材料、滤出液及浓缩液，以确定溶质浓度。8.使用重量/体积数据及所测出的浓度来计算回收量，方法如下：最大化样品回收率浓缩液中的样本回收量低可能由于吸附损失、过度浓缩、或者样本穿过滤膜造成。●吸附损失取决于溶质浓度、其疏水性、温度、与过滤装置表面的接触时间、样本成分及pH值。为最大限度地降低损失，离心后请立即取走浓缩后样本。●如果样本起始浓度高，请监视离心过程，以免