黄豆芽微核实验报告

生态工程学院遗传学设计性实验报告题目：黄豆根尖微核技术系别：生态工程学院专业班级：生物科学2012级组员姓名：孟迎、罗廷、何忠平蔡国宪、丁琴姓名：罗廷学号：28111201029指导教师：蹇黎完成时间：2015年6月11日黄豆根尖微核实验报告一、实验目的1、了解环境诱变物对微核产生的原理。2、掌握微核试验技术。3、了解毒理遗传学在环境监测中的应用及意义二、实验原理微核简称(MCN)，是真核生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生。微核是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期由于不能向两极移动而游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，可在它附近看到若干个圆形的结构，游离于主核之外直径大约是细胞直径的1/20到1/5，这就是微核。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，但有些实验也证明整条的染色体或多条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。所以可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们需要有一套高度灵敏、技术简单的测试系统来监视环境的变化。微核产生的概率可与诱变因子的剂量成正比，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。随着经济发展、经济总量增加，废水排放总量增长迅速，污染物排放总量超过水环境容量，尤其在一些人口密集、企业密布或重污染企业分布较多的区域。水质恶化问题已经比较突出；饮用水水源地有机污染日渐严重，饮用水安全问题已经显现，人民群众生产、生活受到影响。利用毕节市流仓河道河水以黄豆萌发的芽作为实验材料进行微核测试，一方面可准确的显示各种处理诱发植物畸变的效果，另一方面可用于当今发展地区对河道污染程度的间接反应和监测。三、实验器具、药品1、实验材料黄豆种子（贵州工程应用技术学院生态工程学院实验中心供给）2、实验器材光学显微镜、试管（10ml）、烧杯、镊子、手术刀、载玻片、盖玻片、滤纸等。3、试剂1）NaN3(叠氮钠)2）卡诺氏固定液（乙醇和冰醋酸按照体积比3：1混合配制）3）卡宝染色液（Carbolfuchsin）又称改良石炭酸品红，改良苯酚品红。种类成分、配置方法保存时间A液取3g碱性品红溶于100mL的70%乙醇中长期保存B液取A液10mL，加入90mL的5%石炭酸（又称苯酚）水溶液限2周内C液取B液55mL，加乙酸和福尔马林（37％甲醛水溶液）各6mL染色液取原液C20～30mL，加45%的乙酸70～80mL，再加山梨醇1.8g4）6mol/L盐酸：配制：取49.5ml37.5%的盐酸，再加入50.5ml水稀释至100ml容量瓶.四、实验步骤1、种子处理：黄豆种子洗涤干净，室温（25℃）下用蒸馏水浸泡发芽24小时，此间至少换水两次，所换水应预温至25℃。种子吸涨后，移入铺有干净纱布的托盘内，在25℃温箱中催芽培养（4-5天），当初生根长到2cm时，选取发育良好的，大小与根长相似的芽，进行进一步实验。2、检测液采集与处理采集流仓桥不同河段河水，沿河道周边从梦溪湾到泰丰源，从泰丰源至毕节技术学院，从碧阳湖至毕节师专大桥，这三个河段可的上、中、下游三个不同位置的河水混合。瞬时采样吗，采集三个样本，每份两升以上，水样暂存于矿泉水瓶或水壶，并做好标记。3、实验处理每一处理选取6-8粒生长良好、芽长一致的种子，放入盛有待测物溶液的培养皿中，浸没发芽种子。用被检测液处理种子，用蒸馏水作阴性对照，处理种子6～24h（处理时间可视实验需要和被测液浓度而定）。4、根尖细胞恢复培养将处理后的种子用蒸馏水浸洗三次，每次2-3min。将洗净的种子再放入铺好滤纸的托盘内25℃温箱中恢复培养22-24小时。5、固定：吸取5ml的卡诺氏固定液于10ml试管中，用刀片或小剪刀切取经过处理的长约0.5-1.0cm的黄豆芽10-20条，放入试管内，用试管塞盖紧，室温下固定20-24小时，固定液的用量为材料体积的15倍以上。固定后如果不及时制片，可换入70%的乙醇中，置4℃冰箱内保存备用。6、酸解：取出固定好的黄豆芽，用蒸馏水冲洗３min，洗净蒸馏水，加入6mol/L盐酸将芽浸没，室温下酸解10分钟，待芽软化即可。7、染色：解离后材料水洗3min并吸干，挑取1个芽的尖部分生组织于载玻片上夹碎捣烂，滴加1～2滴改良苯酚品红染液，染色10～15min，压片。8、压片在经染色的材料上加一滴染液，盖上盖玻片，覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打，或以拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动)，使材料分散压平，便于观察。9、镜检及微核识别标准首先在低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察。微核识别标准：（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。（2）小核着色与主核相当或稍浅。（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。每一处理观察3个根尖，每个根尖计数1000个细胞中的微核数并进行记录。10、微核率及微核指数计算（1）计算微核率（‰）：1000细胞数溶液染毒根尖观察到的微核数溶液染毒根尖观察到的微核率（2）计算微核指数（MI）：阴性对照的微核率样本的微核率）微核指数（MI用微核指数作为判断实验样本是否致黄豆芽细胞突变的指标，以直观反映实验材料是否致突变及其严重程度。污染指数在0～1.5区间为基本没有污染；1.5～2区间为轻污染；2～3.5区间为中污染；3.5以上为重污染，将样本的黄豆芽微核指数大于1.5定为开始产生致突变作用。五、实验结果1、实验进程记录（包括预实验）1）实验进程及处理（1）从碧阳湖至毕节学院河段河水处理种子前后发芽情况（处理1）从以下记录可知：种子用检测液处理后种子芽生长伸长，且芽的直径变得膨大。但种子及芽的颜色有一定的变黑，甚至有的种子出现了溃烂。从碧阳湖至毕节学院河段河水处理前从碧阳湖至毕节学院河段河水处理后（2）从泰丰源至毕节技术学院河段河水处理前后发芽情况（处理2）从以下记录可知：种子用检测液处理后种子芽也生长伸长了，芽的直径也变得膨大，种子及芽的颜色也有一定的变黑，也有种子溃烂。但是其芽颜色变黑程度较上述实验（1）的浅，其溃烂种子数量也较实验（1）的少。从泰丰源至毕节技术学院河段河水处理前从泰丰源至毕节技术学院河段河水处理后（3）从梦溪湾至毕节技术学院河段河水处理前后发芽情况（处理3）从以下记录可知：和上述实验结果相似，种子用检测液处理后种子芽也生长伸长了，且芽的直径变得膨大，种子及芽的颜色也有一定的变黑，也有种子溃烂。但是相对实验（2）的实验结果而言，其芽颜色变黑程度不及实验（2）的变化明显，其溃烂种子数量也较实验（2）的还少。从梦溪湾至毕节技术学院河段河水处理前从梦溪湾至毕节技术学院河段河水处理后（4）蒸馏水阴性对照处理前后发芽情况（阴性对照）从以下记录可知：种子有蒸馏水处理前后种子，种子的芽仅仅只有伸长生长，没有出现直径的增粗膨大，也没有出现芽的变色和根的溃烂等现象。蒸馏水阴性对照处理前蒸馏水阴性对照处理后2）镜检下微核的识别及微核数的记录在40×10的高倍镜下可见：在间期细胞的细胞核的附近有若干个圆形的结构，直径大约是细胞直径的1/20到1/5的结构，这就是微核。还可见在分裂期的细胞前期、中期和后期的细胞内有为数不多的染色体，且在染色体周围分布有许多椭圆形的微核，而在分裂末期的细胞中可见除了少数不多的染色体被平均分配到两个子细胞内外，微核并没有被分到两个子细胞内，而是一个子细胞有许多的微核，而另一个细胞仅仅几个微核甚至没有。不同河水处理黄豆芽在显微镜下的微核数记录六、实验分析1、注意事项（1）固定材料如果不能及时使用：可以经过90％酒精换到70％酒精中各半小时，换入70％酒精，0-4摄氏度保存半年，再观察时换用固定液再处理一次，效果较好。（2）化学药品处理浓度太高，会导致细胞核变形，而不是形成微核，故应该多设浓度梯度或进行预实验。阴性对照处理1处理2处理3微核数31116348微核率（‰）0.13.72.11.6微核指数MI3.72.12.12、实验结果分析与讨论从碧阳湖至毕节学院河段河水处理种子（处理1）微核率和微核指数最大，其河道被污染从，泰丰源至毕节技术学院河段河水处理种子（处理2）的微核率和微核指数比从梦溪湾至毕节技术学院河段河水处理种子（处理3）的大从所采集的三个不同河段其周围的聚集人口的密集程度来说，从碧阳湖至毕节学院河段所处毕节市城区位置，加上碧阳湖水库的建立以及周边较多建筑工业的实施，使得该区域段人口相对较为密集，污染程度相对较大，所以该河段的微核率及微核指数较大。而从泰丰源至毕节技术学院与从梦溪湾至毕节技术学院这两个河段由于离公路有一定的距离加上其上游从梦溪湾上去基本上很少有人的过往，因此显得其污染相对较轻。但是由于其河岸农民对土地施用一定的农药或者倾倒生活垃圾，从而使得河水受到相应的污染。相对从梦溪湾至毕节技术学院河段，从泰丰源至毕节技术学院这段河段，人流的活动量较多，其污染程度也较大，所以其微核检测指数也较大。3、微核率与处理药物的浓度的关系一般情况下，微核产生的概率与诱变因子的剂量成正比，其概率也与处理药物的浓度成正比，即处理药物的浓度越大，其微核率也越大，