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环境中诱变物质的微核检测摘要：微核是间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构，是染色体发生畸变的另一种表现形式，微核发生率用来反映诱变物质对生物的遗传危害程度。本实验以大蒜根尖作为实验材料，分别以清水和一定梯度的叠氮化钠溶液作为阴性对照和阳性对照，用一定梯度的咖啡溶液和电池浸出液对实验组大蒜根尖进行诱变。最后卡诺固定液进行固定、用改良苯酚品红染色、压片后观察统计各组的微核千分率，从而了解微核检测的方法和意义以及通过检测评价环境中常见物质的诱变情况。1.引言微核是间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构，是有丝分裂后期丧失着丝粒的落后的染色体片段形成。微核是染色体畸变的一种表现方式。许多能引起染色体断裂的理化因素，如辐射、化学诱变剂等，均可作用于分裂细胞而产生微核。目前研究表明，微核发生率同作用因子的剂量呈正相关，微核发生率来反映诱变物质对生物的遗传危害程度。微核试验是一种建立在细胞水平上分析DNA损伤的技术。该技术以其经济、简便、快速、敏感、特异、准确等特点，成为检测致突变剂和环境污染物等经典的短期试验方法。目前许多国家和国际组织将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理性安全性评价的必做试验并用于染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。本试验采用大蒜作为试验材料，具有许多优点：①用鳞茎进行无性增殖，避免了有性生殖过程中的遗传性变异，具有遗传背景稳定的优势；②分布广、材料易得，不受地区和季节的限制；③培养方便，操作简单，蒜瓣去皮后将基部浸入净水中即可萌生新根，无需其他条件，且蒜瓣体积较小，萌生新根的数目较多；④价格低廉，对诱变剂敏感，是一种理想的试验材料。近年来，由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出，日常生活中人类接触到的有潜在遗传毒性的物质越来越多，其中一个较为突出的就是废旧电池的污染。废旧电池中的化学物质不断渗透在环境中，其污染将持续若干年，直接或间接的影响人们的身体健康，造成很大的危害。咖啡的主要成分为咖啡因。德国生态学《okeo-test》的研究人员发现，他们所检测的所有24种品牌的研磨咖啡和7个品牌的浓咖啡中都含有致癌物质——丙烯酰胺。检测结果发现，丙烯酰胺也存在于煮熟的咖啡中。绝大多数研究均表明咖啡与膀胱癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等癌症有一定的关系。为了研究电池浸出液和电池咖啡是否真正具有诱变致癌作用，本次实验通过用咖啡和电池浸出液进行大蒜诱变培养，在阴性和阳性对照设计下，计算其微核率，通过微核检测技术评价咖啡和电池浸出液的诱变情况。2.实验材料与方法2.1实验材料材料：大蒜器材:培养皿、单面刀片、双面刀片、Eppendorf管、油性记号笔、显微镜、载玻片、盖玻片、镊子；试剂：冰醋酸、无水乙醇、1MHCl溶液、100mmol/LNaN3溶液、电池内部粉末、雀巢速溶咖啡粉末，改良苯酚品红。2.2实验方法2.2.1取材选取生长良好、大小相对一致的大蒜，剥成一瓣瓣后置于放清水的培养皿中。于24℃水中浸泡24-36h,选择根长整齐一致，不定根长约0.5－1cm左右的大蒜随机分组。2.2.2处理各实验组将实验材料分为六组，放入8ml不同成分的培养液中，其中1组为阴性对照组，培养液为清水；2、3组为阳性对照组，培养液分别为25mmol/L、50mmol/LNaN3溶液；5——8组培养液分别为0.50g/ml浓度的咖啡和0.25g/ml浓度的咖啡以及分别添加2.5g和5.0g的电池内部粉末。将培养皿中置于20摄氏度左右室温下培养24h。表1实验组浓度梯度的设定阴性对照组阳性对照组实验组1组2组3组5组6组7组8组清水25mmol/LNaN350mmol/LNaN30.50g/ml咖啡0.25g/ml咖啡2.5g电池5.0g电池也可以设定时间梯度，检测微核的形成情况。实验组如下(实验组采用的诱变剂是NaN3，既是实验组，又是阳性对照组)表2实验组时间梯度的设定阴性对照（清水）实验组(NaN3)1组2组3组4组5组24h12h24h36h48h2.2.3恢复培养24小时。2.3.4固定卡诺固定液中固定24小时，如不立即检测可移至70%乙醇中4℃下保存。2.3.5制片①根尖用1MHCl处理的10min,水洗3次。②切取近根尖分生区的伸长区组织，用改良苯酚品红染色10min。③压片：加上盖玻片后，用铅笔轻敲使细胞分散，最后垂直压下去。2.3.6镜检每个根尖计数1000个细胞，统计含微核的细胞数，然后取平均值，即为该处理的微核千分率。2.3结果2.3.1实验结果图图1含微核的细胞（10*40）图2含微核的细胞（10*40）图31组（10*40）图42组（10*40）图53组（10*40）图64组（10*40）图75组（10*40）图86组、7组（10*40）2.3.2实验结果分析与统计图1、2中可以看到含有微核的细胞，这些细胞都有以下特征：（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。（2）小核着色与主核相当或稍浅。（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。图3-8分别为1-6组的其中一个视野结果图。其中，图3中为清水组，没有微核的出现，但是由于加入的染液太多，使得背景呈现紫红色。图4——7视野中均有微核的出现：图4的视野中的某些细胞由于敲片力度过大导致细胞破裂；图5为50mmol/l的NaN3溶液，可看到溶液中几乎全是微核，说明NaN3诱导微核的能力很强。图5与图6进行对照，可看到咖啡的确具有一定的致癌作用，并且浓度越高，致癌作用越强烈。图8为加入电池内部粉末的实验组，从图中可以看出，没有存活细胞，细胞均死亡，只留下细胞壁。说明我们加入的电池粉末浓度太高，已将细胞全部杀死，不能检测微核的千分率。数据分析如下：表3实验数据分析组别阴性对照组阳性对照组实验组1组2组3组4组5组6组7组培养液清水25mmol/LNaN350mmol/LNaN30.25g/ml咖啡0.5g/ml咖啡2.5g电池粉末2.5g电池粉末微核检出率（%）021100938无法计算无法计算根据数据我们发现，咖啡存在一定的致癌率，但致癌作用要弱于NaN3。随着咖啡浓度的升高，微核率也相应增多。由于实验设计存在一些问题，根尖的数量相对较少，实验组的浓度梯度设计的不够多，所以仅根据本次实验无法得出微核率最大的咖啡浓度，只能进行定性分析。而电池浸出液对照组，因为我们加入的电池粉末太多，导致电池浸出液浓度太高，极大地影响了大蒜根尖的生存，导致他们均死亡，无法检测电池粉末对微核的诱变作用。3.讨论实验分析微核是由有有丝分裂过程中的染色体断片，或丝分裂后期丧失着丝粒的染色体产生的，这些染色体可以使一条，几条染色体也能形成微核。这些断片或脱离的染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，当子细胞进入下一个分裂间期时，它们便浓缩形成主核之外的小核，即形成了微核。微核的判定标准：①凡主核大小的三分之一以下的小核；②小核着色不论深浅；③小核形态可以是圆形，椭圆形，不规则形；④小核可以与主核分离，与主核有丝或蒂相连，与主核相依，但各自轮廓楞楚的都可作为微核计入，但须注意不要将染色中心当作微核计入。我们找微核时应注意找的根尖区域。由于进行了恢复培养，形成了微核的细胞应处于靠近分生区的伸长区中，压片观察此区域中的细胞呈正方形，或稍偏长方形，若观察到细胞明显拉长，且细胞核呈长条状的细胞，则为伸长区细胞。对根尖进行压片观察，清水作为阴性对照组，没有观察到微核，可推测无诱变作用或诱变作用很弱；已知NaN3有很强的诱变作用，所以用25、50mmol/l的NaN3作为阳性对照组，其中50mmol/l的NaN3的根尖压片中可观察到大量微核，其数量是所有实验组中最大的，其千分率几乎为100%。实验组分别用不同浓度的咖啡溶液进行处理，由表中数据可看出，咖啡有诱变作用。且由四组和五组的微核率可以看出，微核发生率同作用因子的剂量呈正相关。这也警示我们日常生活中要少喝咖啡；而电池浸出液浓度太高，已将根尖细胞完全杀死，我们失败的原因是设计实验之前未充分的阅读文献，导致我们的梯度设计的不够合理。这也提醒我们做实验时实验梯度必须谨慎设计，太高会抑制细胞的活动，使细胞分裂活动延缓或终止停止，甚至死亡，以后的实验设计中必须牢记这一点。从实验数据来看,我们组的微核率普遍偏高,这也反映了我们组没有合理的设计实验梯度,设计的浓度普遍偏高,没有差异,这也为我们提醒了日后独立设计实验时,必须充分阅读资料,制定合理的梯度.从图中可看出，此次实验压片效果不是很好，对微核率的统计及实验结果造成影响。图6中细胞轮廓不清晰，而且与周围细胞对比可看出装片中有多层细胞重叠的状况，压片时没有使细胞充分分散开。虽然此次实验不需观察染色体，对压片没有那么高的要求，但依旧不能松懈，要做到视野中单层细胞，且细胞不重叠，计数才能更准确，才能获得较好的实验结果。实验注意事项及改进之处1.由于培养大蒜的时候，放的大蒜不够多，导致长出根的大蒜相对较少，根的数量有限，难以进行多组实验。2.敲片的力度一定要掌握好，不能过重，也不能过轻。力度过大会导致细胞破裂，无法观察和计数含有微核的细胞。过轻会导致出现多层细胞重叠的现象，也影响微核的观察与计数。3.NaN3见光会分解，所以在用溶液处理材料时，不要把培养皿放置在窗台，最好放置在恒温箱中，以免对实验产生误差。4.后续实验中，可以在本次实验的基础上，再设置不同浓度梯度的咖啡实验组，并且分别处理不同的时间，来观察相应的结果，进行定量分析。而对于电池粉末组则应该在充分阅读相关文献的基础上，重新设计适当的浓度梯度的实验组。6.切取根尖时要准确，若切取组织过大，制片后视野中细胞过多，且多层，影响观察；若过小，则丢失细胞。两种情况都会造成观察到微核偏少的现象。我们切取的应是根尖伸长区的细胞7.在解离之前和之后，均要用清水洗涤根尖，否则前者影响解离，后者影响染色。8.若诱变因子浓度较低，则微核较少；压片时可能压入杂质，染液也可能产生沉淀，所以在压片之后需要认真地进行镜检，不漏掉一个微核，也不把杂质误认为微核。实验总结本次实验，我们成功的通过微核检测技术评价咖啡诱变情况，所以日后应该少喝咖啡，并且本次实验我们虽然没有成功的检测电池浸出液的诱变作用，但是也可以从实验中验证废旧电池对生物的巨大危害，这提示我们今后一定要注意不能随意丢弃废旧电池，做好回收工作。此外，生物实验中很重要的一方面就是制作好的片子，要努力制取单层细胞，不发生细胞的重叠。还有今后设计实验,必须设计合理的梯度,多读文献,了解背景知识.参考文献【1】曾雪、王旭、周材劝、李明、杨艳、都红圩、王山丹.废旧电池液对多刺裸腹溞的毒性研究.西华师范大学学报.2010年12月.【2】徐秀芳、张海洋、于淑池.秋水仙素诱导大蒜微核的遗传学实验方法研究.安徽农业科学.2012年15期【3】致癌抗癌咖啡是敌还是友.黑龙江科技信息.2013年20期。【4】崔蕴霞,崔常安.咖啡与致癌(综述)[J].暨南大学学报(自然科学与医学版),1995,2