搜索
实验一：EV71病毒非结构基因（2b）的克隆一．实验目的通过本实验使学生掌握外源基因克隆的原理和方法二．实验原理基因克隆技术包括把来自不同生物的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外进行人工连接，构建成新的含目的基因的重组载体，然后将其导入受体生物中去进行表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。三．实验用品１.材料：EV71病毒基因组序列载体pMAL-c2x（Amp抗性）大肠杆菌DH5a２.器材：离心机、DNA电泳仪、微波炉、试管、摇床、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、培养皿等、三角瓶、天平３.试剂与药品：氨苄青霉素、碱性裂解液、电泳缓冲液、RnaseA、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、1kb分子量DNAMarker、内切酶BamHI和SalI、DNA片段胶回收试剂盒、X-gal贮液、IPTG贮液、Tris碱、Na2EDTA、NaCl、CaCl2、甘油、葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨、分析纯无水乙醇、95%医用酒精、琼脂糖四．方法与步骤（一）缓冲液及培养基配制1.质粒提取试剂：溶液I：葡萄糖50mmol/L,Tris-HCl(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L于6.895×104Pa灭菌15min，4℃保存。溶液II：NaOH0.2mol/L，SDS1%。SDS（10%，200ml）：20gSDS，慢慢转移到约150ml水的烧杯中，磁力搅拌至溶解，用水定容至200ml。溶液III:（0.5M，pH5.2，KAC）,用冰醋酸调pHTE缓冲液：1mlTris-HCl(1MpH8.0),0.2mlEDTA(0.5MpH8.0),加灭菌水至100ml。2.LB液体培养基（perliter）:胰蛋白胨10g酵母膏5gpH7.0NaCl5g(二).步骤1．碱裂解法抽提质粒实验原理：在pH12.0～12.6碱性环境中，细菌的染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。步骤：1）接种一单菌落于5ml液体培养基中，加适量抗菌素，37℃摇床培养过夜；2）取1.5ml(制备低拷贝质粒取5ml),12000r/min,离心1min（菌较多时可富集）；3)吸尽上清液，悬浮菌体于200ul预冷的溶液I中；4）加入溶液II，400uL,用手颠倒7-8次，至菌液完全清亮，并有拉丝现象比较粘稠；5)加入溶液III，300uL，用手颠倒7-8次；6）离心（12000/min）10min；将上清转入新的EP管中；7)离心（12000/min）10min，将上清转入新的EP管中，弃去沉淀；9)加入异丙醇（1倍体积）750uL，颠倒几次混匀；放置5min；10)离心（12000/min）10min，弃去上清；11)加入70%乙醇500uL，放置2min；12)离心（12000/min）2min；弃尽上清；13)37℃放置10min（培养箱）干燥；14）加入50uLTE或者灭菌的超纯水融解DNA。15）质粒检测完毕后，置于-20℃保存附注：质粒检测电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。2．EV71非结构基因2b引物设计：F15‘cgggatccagcgcttcctgg3’BamHI（上游）F25‘gcgtcgacttattggaatagag’SalI（下游）3.目的片段EV712B基因PCR扩增和纯化；实验原理：PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。实验步骤：1.按下列体系配制反应混合液：TemplateDNA0.5μl（20ng）10×buffer2μlPrimerF(50μM)0.5μlPrimerR(50μM)0.5μldNTPs（10mM）0.5μlTaq（5U/μl）0.5μlAddddH2Oto19.5μl2.反应程序设置:预变性94℃3min变性94℃30s退火62℃30s共33循环延伸72℃30s延伸72℃10min3.PCR产物纯化根据天北京鼎国科技有限公司提供的小量DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物，（按照试剂盒说明书）操作过程如下：1）在DNA凝胶成像系统下切下所需的DNA条带装入已知重量的Eppendorf管中，并称重计算胶条的重量（W毫克）；2）加入2倍于W体积的S1液，置50℃水浴10min,使琼脂糖完全融化，不时颠倒混匀；3）转移到柱子上如果总体积大于750uL,过柱时要分批上柱，每一次离心30s,倒掉收集管中的液体；4）加入500uL的含乙醇的W1液，12000转，离心15s,弃去收集管中的液体；5）加入500uL的W1液，静置1min,离心15s，弃去收集管中的液体；6）再离心1min；7）将吸附柱放入一干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30uLT1（2mMTris）液或水，静置5min，离心1min；8）将1.5ml离心管存于-20℃。5.目的基因PCR产物和载体的酶切及产物纯化回收：1）按照下面酶切体系，分别依次加入纯化好的2bDNA，ddH2O，Buffer，BSA，酶。I.PCR产物酶切体系：DNA20ul10×buffer8ulBamHI2ul37℃，保温5-6h.SalI2ulddH2O48ulII.载体pMAL-c2x酶切体系：载体DNA10ul10×buffer5ulBamHI2ul37℃，保温5-6h.SalI2ulddH2O31ul2)酶切产物检测：分别取3μl外源片段酶切产物和3μl载体pMAL-c2x酶切产物于1.0%琼脂糖凝胶检测酶切是否完全.3）酶切产物回收：（按照北京鼎国DNA胶回收试剂盒的操作方法）①将PCR酶切产物和载体酶切产物按照1：3加入溶液A②转移到柱上，静置3min，10000g离心1min。③将滤过的溶液，再次吸入柱内，重复步骤2.④弃掉滤液，向柱内加500ul溶液C，12000g离心1min。⑤重复操作④后，12000g再次离心3min。⑥将吸附柱放入一干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30uLT1（2mMTris）液或水，静置5min，离心1min。（加水前保证乙醇完全除净）⑦回收酶切产物放存于-20℃。4）酶切回收产物检测：取2ul于1.0%琼脂糖凝胶检测.6.DNA体外连接反应1）按照下列体系完成连接体系：2b酶切回收产物13uL载体4uLT4DNA连接酶1uL20ul10×T4DNAligaseBuffer2.0uLddH2O0uL2）混合均匀后，于16℃或者4℃连接过夜。4.大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞1）挑取保存的感受态细胞在平板上划单菌落；2）挑取长好的单菌落接入到装有5mlLB的三角瓶中，摇床过夜培养；3）从universal中取1ml过夜培养物，转接于装有20mlLB（用SOC或SOB可提高感受态效率）的250ml三角瓶中，培养2.5~3小时至OD600＝0.6；4）将培养物倒入50ml已预冷的大离心管中，置于冰上待冷却；5）离心，4℃.5000rpm.3分钟；6）倒去上清液，先加少量0.1MCaCl2，打散沉淀，再加10ml，混匀，于冰上放置至少30分或过夜；7）离心，4℃.5000rpm，3分钟；8）弃上清，加1ml0.1MCaCl2，在冰上轻轻打散沉淀，即可使用。以上步骤均需注意无菌和低温操作。附注：影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；5．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；8..DNA转化实验原理：热激法：大肠杆菌在0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子实验步骤：1)取100μl感受态细胞和5ul的酶连产物或1-2ul质粒混合；2)冰上静置30分钟；3)42℃热激90秒，然后在冰上放置5min；4)加0.75mlLB培养基，在37度摇床上培养45分钟。然后3600转离心2分钟，去掉大部分上清（此步不作为快转，作为慢转，慢转可提高效率，有些抗生素如Kan筛选时用慢转较好）；5)涂布于有抗生素的筛选平板，一般12小时可有转化子出现。9.重组质粒pMAL-c2X-2b鉴定1）用消毒的牙签仔无菌工作台上挑取白斑，放于含5ml的LB培养基（加入Amp）过夜培养。2）按以上步骤1提取质粒3）按以上步骤3做PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测片段的大小。4）对提取的质粒步骤4酶切，然后用琼脂糖凝胶电泳检测片段的大小，是否为目的带。5）对提取的质粒进行测序进一步检测克隆片段完全正确。实验二：融合蛋白MBP-2b的诱导表达一.实验目的：通过本实验了解蛋白质的原核表达二.实验原理；将外源基因克隆在pMAL-c2x表达载体中，让其在E．coli如中表达。先让宿主菌生长，IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖)诱导的tac启动子紧邻多克隆位点和rrnb终止子，连接区跨越B—半乳糖苷酶a-互补片段氨基末端，可以通过蓝白斑筛选质粒中有外源片段插入的克隆。由于质粒中同时含有lacI基因的cIq等位基因，因此在大多数的大肠杆菌中都可以利用IPTG诱导MBP融合蛋白的表达。表达的融合蛋白（MBP-2b）可经SDS-PAGE检测或做Western-blotting，用抗体识别之。三.实验内容1.融合蛋白（MBP-2b）小规模诱导表达2.SDS－PAGE电泳技术；3.westernBlot技术4.银染对SDS－PAGE胶显色四．实验用品１.材料：重组质粒pMAL-c2x-2b（Amp抗性）大肠杆菌DH5a２.器材：离心机、电泳仪、试管、摇床、酒精灯等３.试剂与药品：PBS、氨苄青霉素、碱性裂解液、电泳缓冲液、低分子量标准蛋白Marker、X-gal贮液、IPTG贮液、Amylose纯化柱、WesternBlotting使用的一抗和二抗等：五.实验方法与步骤（一）培养基配制：1.培养基LB液体培养基（perliter）:胰蛋白胨10g酵母膏5gpH7.0NaCl5g（二）.SDS-PAGE及WB所用试剂：1.配制母液：30%丙稀酰胺(Acr母液)：29g丙烯酰胺和1gN,N‘–亚甲双丙烯酰胺加入温热的去离子水中，确保溶液的pH值不超过7.0,置暗色瓶中室温保存。10％的SDS溶液:10gSDS加蒸馏水至100ml，50℃水浴下溶解，室温保存10％的过硫酸铵溶液: