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一种嗜热嗜碱过氧化氢酶的分离纯化及鉴定摘要：试图从嗜热嗜碱的嗜热子囊菌中分离纯化过氧化氢酶,以得到具有嗜热嗜碱性质的过氧化氢酶。根据研究表明，嗜热嗜碱的嗜热子囊菌中的过氧化氢酶该酶为双亚基结构,分子量约为1·9×105,亚基分子量约为9·5×104，。并且嗜热嗜碱过氧化氢酶均在广泛的pH范围内表现稳定,酶亚基分子量较大,而大分子亚基被发现有更好的温度、pH稳定性,H2O2耐受性[19]。现在通过对酶的盐析及透析除盐、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析等方法对其进行分离纯化，通过对其分子质量的测定、酶活力的测定，等对其进行鉴定。关键词：过氧化氢酶分离纯化鉴定1实验流程图2实验步骤2.1菌种培养从-20℃冰箱保藏的嗜热子囊菌菌种挑取一环接入盛有70mL种子培养基中(糖度为6°P的天然麦芽汁，pH7.5)的250mL摇瓶中，在37℃、200r/min培养12h.然后以6%接种量接种至装有80mL发酵培养基的500mL摇瓶中，在37℃、200r/min培养30h.2.2酶的盐析及透析除盐取发酵液,过滤去除菌体,加硫酸铵至饱和度50%,5℃下过夜,10000r·min-1离心15min,除去沉淀（除去其他不溶性杂质）,上清液继续加入硫酸铵至饱和度90%,5℃下静置12h,离心收集沉淀,用少量10mmol·L-1的Tris-HCl(pH8·0)缓冲液溶解,蒸馏水透析48h（除去硫酸铵等小分子离子杂质）,透析后的酶液5℃下保存，得到嗜热嗜碱过氧化氢酶的粗提取物。2.3DEAE-Sepharose离子交换层析DEAE-Sepharose离子交换层析柱经0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)平衡后，初酶液上样5mL，用0～1mol/L的NaCl溶液(用0.05mol/L，pH7.2的磷酸缓冲液配制)进行线性梯度洗脱，流速30mL/h，每管收集5mL；然后测定各管CAT活力和蛋白质含量，收集活性较高的各管酶液（得到嗜热嗜碱过氧化氢酶的细提取物），4℃蒸馏水透析脱盐过夜。2.4Superdex-200凝胶过滤层析取经离子交换层析得到的酶活性较高的酶液3mL上样于Superdex-200凝胶柱，生理盐水洗脱，流速18mL/h，每管收集3mL。测定每管酶活力以及蛋白质含量；收集酶活力较高的各管酶液，4℃蒸馏水透析脱盐，冷冻干燥后，于－20℃冰箱保存备用。（基本得到纯的嗜热嗜碱过氧化氢酶）2.5CAT纯度鉴定采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行CAT的纯度鉴定，采用质量分数12%的分离胶，质量分数5%的浓缩胶，取经过3.4过程的活性最高的酶液，上样量10μL，电泳后，若得仅得到一条带，则该样品已经达到电泳纯。菌种培养及发酵，得嗜热嗜碱过氧化氢酶酶的盐析及透析除盐,得到酶的粗提物DEAE-Sepharose离子交换层析，得到较纯酶酶活力检测，判断是否为过氧化氢酶用SDS-PAGE标准蛋白做图，测其亚基分子量Superdex-200凝胶过滤层析，得到纯化酶3鉴定3.1CAT分子质量测定亚基分子量的测定采用SDS-PAGE方法，根据已知Mr的标准蛋白在SDS-PAGE中的相对迁移率Rf，作Rf-LogMr图，求得酶亚基分子量.3.2酶活力测定采用分光光度法在37℃下测定.反应总体积为3mL，含0.1mL酶液样品和2.9mL含10mmolL-1的50mmolL-1KH2PO4–Na2HPO4缓冲液(pH7.0)，H2O2的分解速率用UV-2450型紫外可见光分光光度计在240nm下测定.酶活定义为：在37℃下，分解H2O21μmolmin-1所需的酶量为一个酶活单位。根据酶活性来判定是否为分离纯化后的过氧化氢酶。