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猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告摘要：碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度1前言碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。1.1实验目的掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。1.2实验试剂与仪器1.2.1实验仪器电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机1.2.2实验试剂及配制95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠（1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。（2）0.01mol/LTris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/LTris溶液；取0.1mol/LTris溶液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.5mol/L醋酸镁20mL，混匀后用1%醋酸溶液调节pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000mL即可。（3）0.05mol/L硫酸镁（4）0.5mol/LNaOH（5）标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成100ug/mL的原液。（6）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250。溶于50mL90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。1.2.3其他用品手术剪；50mL离心管；烧杯；容量瓶；漏斗；量筒；玻璃棒；滤纸；移液枪（1000uL,100uL）等。1.3实验材料猪肝，冰柜冷冻储存2实验方法2.1猪肝中碱性磷酸酶的提取将10g新鲜猪肝置于冰箱进行预先冷冻处理后取出，置于玻璃匀浆器内，加入0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液30mL，充分研磨至糊状。将匀浆液倒入刻度离心管中，记录其体积V1=45mL，用移液器吸出0.1mL置另一支小试管中，在此试管中加4.9mLTris－醋酸镁缓冲液（pH8.8），即50倍稀释，待测比活性用，为A液。加10mL正丁醇于匀浆原液中，用玻棒充分搅匀，然后放置冰浴中20min。用滤纸过滤，滤液置于另一支刻度离心管中。滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心（8000r/min）5min，弃去上清液，在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁20mL，用玻棒充分搅拌使其溶解，记录溶液体积V2=24mL。用移液器吸取0.1mL，置于另一支小试管中，并加入4.9mLTris－醋酸镁缓冲液（pH8.8），即50倍稀释，待测比活性用，为B液。在溶液中缓慢加入冷95%乙醇，使乙醇最终浓度达30%，混匀后离心（8000r/min）5min。将上清液倒入另一支离心管中，弃去沉淀。上清液中加入冷95%乙醇，使乙醇最终浓度达60%，混匀后离心（8000r/min）5min。弃去上清液，沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁15mL，用玻棒充分搅拌使其溶解，记录体积V3=18mL。用移液器吸取0.1mL置于另一支小试管中，加入4.9mLTris－醋酸镁缓冲液（pH8.8），即50倍稀释，待测比活性用，为C液。上述溶液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮最终浓度在33%。混匀后离心（2000r/min）5min，弃去沉淀，上清液置于另一支刻度离心管中，缓慢加入冷丙酮，使丙酮最终浓度达50%，混匀后离心（8000r/min）10min，弃去上清液，沉淀即为部分纯化的碱性磷酸酶。在此沉淀中加入5mLTris－醋酸镁缓冲液（pH8.8）使其溶解，并记录体积V4=9mL。吸取0.1mL置于另一支小试管中，加入4.9mLTris－醋酸镁缓冲液（pH8.8），缓冲液即进行5倍稀释，待测比活性用，为D液。A液，B液，C液，D液冷冻保存。2.2碱性磷酸酶酶活力测定采用对硝基苯磷酸二钠为底物的方法进行测定，测定方法按下表。分光光度计用蒸馏水调0，吸光度每变化0.001为一个活力单位。酶活力U=（OD420-OD420（空白））*1000。表1酶活力的测定方法空白对照管样品管123蒸馏水1mL样品1mL1mL1mLTris-HCl2mL混合，30℃，5min0.5mol/LNa2CO31mL1mmol/LPNPP溶液1mL混匀，30℃恒温反应10min1mmol/LPNPP溶液1mL0.5mol/LNa2CO31mL混匀，测OD4202.3碱性磷酸酶蛋白质含量测定按紫外分光光度法，采用牛血清白蛋白配制标准蛋白质溶液。再按表1的方法测出数据，绘制出蛋白质浓度的标准曲线。然后按照下面的方法测出蛋白质浓度：取一只试管，准确加入1mL样品提取液，5mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595nm波长下比色，记录吸光度。根据吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量。表2蛋白质标准曲线的测定方法操作项目管号123456标准蛋白质溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20G-250试剂（mL）各5蛋白质含量（ug/mL）0204060801003实验结果与分析3.1碱性磷酸酶的酶活力和蛋白质含量结果A液，B液，C液，D液浓度均为稀释50倍，V1=45mL，V2=24mL，V3=18mL，V4=9mL。表3牛血清白蛋白标准曲线ug/mL020406080100OD值00.1780.2240.3340.40.441表4各溶液中酶活和蛋白质含量OD420酶活/(U/mL)OD595蛋白质/(ug/mL)A0.919102.248511.186B0.7237231.512340.023C0.8788781.059234.674D0.282800.31561.651表5分离纯化各步骤中碱性磷酸酶的相关数据步骤总蛋白（mg）总活力（U）比活力（U/mg）纯化倍数得率（%）匀浆原液A液正丁醇处理B液冷乙醇处理C液冷丙酮处理D液1150.16408.0276211.2127.7420475008676007902001260001780.192126.333741.304542.1811.192.102.5510042.3738.596.153.2PH对碱性磷酸酶的影响查资料所得，碱性磷酸酶的最适PH大约处于8.5~10.5之间，所以设计配制PH分别为7，8，9，10，11，5个阶段的Tris-MgSO4缓冲液，并依次采用该些缓冲溶液进行酶活测定，从而得出碱性磷酸酶的最适PH。所用酶液为B液，用量0.4mL。表6碱性磷酸酶与PH值的关系PH7891011OD4200.1390.2450.440.6850.6713.3温度对碱性磷酸酶的影响测定碱性磷酸酶所使用的温度为30℃，所以可以估计猪肝中的碱性磷酸酶的最适温度在该温度附近，故设计30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，一系列温度，并将上述温度用于酶活测定实验中，根据酶活力的变化得出碱性磷酸酶的最适温度。所用酶液为B液稀释10倍，用量1mL。表7碱性磷酸酶与温度的关系T/℃304050607080OD4200.0740.0860.0760.0430.0360.0293.4实验结果分析猪肝中碱性磷酸酶经冷冻匀浆，正丁醇，冷乙醇，冷丙酮一系列处理后，最后从10g猪肝中得到的碱性磷酸酶的总酶活力为126000U，比活力为4542.18U/mg，得率为6.15%。从中表4，表5可以看出，前面三步操作效果可观，第2步正丁醇处理稍逊于第3步冷乙醇处理，但最后一步，冷丙酮处理，得率不高，可能存在操作的问题。上述实验结果表6，表7可得，猪肝中碱性磷酸酶的最适PH介于10~11之间，而最适温度则位于40℃左右，若要得到更精确的数据，需要进一步实验操作。4总结总的来说，这次关于猪肝中的碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究的自主实验还是成功的，对于将来接触各方各面的实验，具有极大的作用。