蛋白质与多肽类药物的制备

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7.2多肽及蛋白质类药物的生产方法一、蛋白质类药物的分离与纯化(一)材料选择蛋白质类药物的原料来源有动植物组织和微生物等,原则是要选择富含所需蛋白质、多肽成分的、易于获得和易于提取的无害生物材料。对天然蛋白质类药物,为提高质量、产量和降低生产成本,对原料的种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定的要求,了解这可使分离纯化工作事半功倍。(1)种属:牛胰含胰岛素单位比猪胰高,牛为4000IU/kg胰脏,猪为3000IU/kg胰脏。抗原性猪比牛的低。前者与人胰岛素相比,只有1个氨基酸的差异,而牛有3个氨基酸的差异。(2)发育生长阶段:幼年动物的胸腺比较发达,老龄后逐渐萎缩,因此胸腺原料必须采自幼龄动物。肝细胞生长因子是从肝细胞分化最旺盛阶段的胎儿、胎猪或胎牛肝中获得的。若用成年动物,必须经过肝脏部分切除手术后,才能获得富含肝细胞生长因子的原料。(3)生物状态:动物饱食后宰杀,胰脏中的胰岛素含量增加,对提取胰岛素有利,但胆囊收缩素的分泌使胆汁排空,对胆汁的收集不利。严重再生障碍性贫血症患者尿中的EPO含量增加。(4)原料来源:血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取,而稳定性以颚下腺来源为好,因其不含蛋白水解酶。(5)原料解剖学部位:猪胰脏中,胰尾部分含激素较多,而胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提高各产品的收率。胃膜素以采取全胃粘膜为好,胃蛋白酶则以采取胃底部粘膜为好,因胃底部粘膜富含消化腺。(6)对生物技术产品宿主菌或细胞的要求选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。大肠杆菌表达,由于其不能将所表达的蛋白质分泌到体外,故提取时必须破壁,增加了提取的困难,而且还可能含有毒素类有害因子。用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌,虽可解决这一矛盾,但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基化等翻译及修饰的缺陷;用动物细胞和昆虫细胞表达则能比较好地解决后处理及完整表达的问题。用肿瘤细胞作宿主细胞制成的医药产品还应考虑到其安全性问题。(二)蛋白质提纯的一般方法根据蛋白质在溶液中的下列性质分离蛋白质:分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对其他分子的生物亲和力等。1、根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质,在一定pH环境中,某一种蛋白质解离成正、负离子的趋势相等,或解离成两性离子,其净电荷为零,此时环境的pH值即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质性质比较稳定,其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等皆最小,因此可利用蛋白质等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。两性物质的等电点会因条件不同(如在不同离子强度的不同缓冲溶液中,或含有一定的有机溶媒的溶液中)而改变。当盐存在时,蛋白质若结合了较多的阳离子,则等电点向较高的pH值偏移。反之,蛋白质若结合较多的阴离子,则等电点移向较低的pH值。用等电点法沉淀蛋白质常需配合盐析操作,而除去不需要的杂蛋白时,常需配合热变性操作。等电聚焦电泳除了用于分离蛋白质外,也可用于测定蛋白质的等电点。2、根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质蛋白质的一个主要特点是分子大。由此可以用凝胶过滤法、超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其他小分子物质分离,也可将大小不同的蛋白质分离。[注意]用超滤法时,超滤膜截留分子量常与实际情况不一致。分子量相近的蛋白质由于在介质中有呈线形溶质或者是球形溶质的区别,可能出现不同的结果。葡聚糖凝胶含有少量的酸性基团,故有较弱的离子交换作用,此外还有吸附作用。在纯化蛋白质时,可采用低浓度的盐溶液(0.01mol/L),或者用与待分离蛋白质相同的标准蛋白质预先使凝胶柱平衡,以期不损失所分离的蛋白质。3、根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋自质蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的电解质性质及温度等多种因素的影响。在同一特定条件下,不同蛋白质有不同的溶解度,适当改变外界条件,可以有选择地控制某一种蛋白质的溶解度,达到分离的目的。属于这一类的分离方法有蛋白质的盐溶与盐析法、结晶法和低温有机溶剂沉淀法。乙醇和丙酮是有机溶剂沉淀法中最常用的有机溶剂,由于丙酮的介电常数小于乙醇,故丙酮沉淀能力比乙醇强。4、根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质离子交换剂作为一种固定相,本身具有正离子或负离子基团,它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力,从而使这些物质分离提纯。蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。对蛋白质的离子交换层析,一般多用离子交换纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为骨架的离子交换剂。优点:蛋白质吸附容量较大、流速较高、分辨率较高等。对已知等电点的物质,在pH高于其等电点时,用阴离子交换剂,在低于其等电点时,用阳离子交换剂。5、根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质主要的手段是亲和层析法,即利用蛋白质分子能与其相应的配体进行特异的、非共价键的可逆性结合而达到纯化的目的。[注意]非专一性吸附主要来自吸附剂上的离子基团和疏水基团。解决这一问题的方法是从制备和选用吸附剂上着手。固相化金属亲和层析(IMAC)是新发展的一种亲和层析技术。蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些金属元素(如Cu2+、Zn2+等)形成配位结合,使蛋白质得到分离纯化。6、根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质蛋白质分子上有疏水区,它们主要由酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性的侧链密集在一起形成,并暴露于分子表面。这些疏水区,能够与吸附剂上的疏水基团结合,再通过降低介质的离子强度和极性,或用含有去垢剂的溶剂,增高洗脱剂的pH值等方法将蛋白质洗脱下来。用含酚基疏水基团的琼脂糖纯化重组人表皮生长因子(rhEGF),纯度可达94%,回收率达82%。7、根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质这是一种以化合物在两个不相溶的液相之间进行分配为基础的分离过程,称之为逆流分溶。利用逆流分溶技术分离垂体激素、氨基酸、DNA是很有效的。8.根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯化蛋白质蛋白质易受pH、温度、酸、碱、金属离子、蛋白沉淀剂、络合剂等的影响,由于各种蛋白质都存在着差异,可利用这种差异来纯化蛋白质。白蛋白在弱酸性条件下加辛酸钠可耐受67℃的温度,而其他蛋白质将变性。球蛋白或白蛋白在碱性条件下,可以和利凡诺作用,形成络合物而与其他蛋白质分离。细胞色素C和胰岛素可用一定浓度的蛋白沉淀剂如三氯醋酸沉淀,而保存其活力。9、根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质在蛋白质分离中,最广泛使用的吸附剂有结晶磷酸钙(羟灰石)、磷酸钙凝胶、硅胶、皂土沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。诸如催产素、胰岛素、HCG、HMG、细胞包素C等都可以通过吸附层析技术进行纯化。10、根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质对于酶蛋白——超氧化物歧化酶(SOD)的提取,因SOD能抵抗蛋白酶的水解,可用蛋白水解酶降解其他蛋白质,以便于SOD进一步的纯化。γ—球蛋白、ACTH在分子中有活性中心,可用蛋白酶水解切去与生物活性无关的分子部分,保留活性分子片断,使产品纯化。对于无胰岛素生物活性的胰岛素原,用蛋白水解酶可切去胰岛素原分子中的C-肽,使胰岛素激活。一些活性多肽常与其他蛋白质分子结合而不呈现活性或不能够被提取,用蛋白水解酶可以使其与其它蛋白质解离,恢复其生物活性和在溶液中的正常性质(三)蛋白质的分离和纯化的影响因素1.时间因素在蛋白质分离和纯化过程中,共同的问题是蛋白质反应达到平衡所需要的时间,而且为避免蛋白质的变性、微生物的污染等,操作常在低温环境中进行。为更快达到反应平衡,应该考虑到这些因素。通常在25℃时,化学反应的速率是低温5℃时的3~4倍。这与物质的扩散系数有关,而扩散系数受物质的粘度和温度的影响。蛋白质生物大分子反应与小分子化合物不同,后者是以分、秒和毫秒计时的,而前者要10分钟以上。(四)溶液中蛋白质浓度的测定溶液中蛋白质的浓度可根据它们的物理、化学性质,如折射率、比重、紫外光吸收来测定;化学反应方法,如凯氏定氮、双缩脲反应、福林-酚反应测定;也可用染色法,如氨基黑、考马斯亮蓝测定;此外还可用荧光激发、氯胺T、放射性同位素计数等灵敏度较高的方法。上述方法,紫外吸收法、双缩脲法、福林-酚试剂法、考马斯亮蓝染色法最为常用。(五)纯度检查测定蛋白质的纯度是化学和物理学的概念,它和蛋白质所具有的生物活性有着更复杂的关系,蛋白质的聚合状态、辅基的存在、蛋白质的变性作用等极大地影响其生物活性,而这些因素的影响有些往往是用一般纯度检查的方法所查不出来的,纯度检查的方法有:1、HPLC这是蛋白质纯度检查常用的有效方法。美国药典已规定把HPLC用于胰岛素纯度的检测项目中。2、电泳法3.免疫化学法(适用于产生特异性抗体的蛋白)4.生物测定法利用动物体或动物的离体器官、细胞进行生物效价的测定,这种方法接近动物临床所产生的生物学效应,因此实际意义也更大。5、分光光度法(1)紫外分光光度法(2)红外分光光度法(蛋白分子结构有特别能级,红外提供分子指纹)二、多肽与蛋白质的化学合成(自学)多肽的合成是50年代开始,在有机溶剂中进行的均相反应,因此叫作液相合成法,此法在合成分子量不太大的多肽时是比较成功的,但在合成更大的蛋白质时,产物还不能表现出全部活力且不能结晶,1962年建立的固相合成的新方法,对小肽的合成是很成功的,对大分子的合成,如124肽的核糖核酸酶,还不能达到天然物质的全部活力。目前试图合成大的蛋白质以及建立快速简便的合成方法是多肽合成化学的特征。在多肽合成中,一般需要以下几个主要步骤:①氨基保护和羧基活化;②羧基保护和氨基活化;③接肽和除去保护基团。三、多肽类药物(一)概述活性多肽是生化药物中非常活跃的一个领域,生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺、组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的。许多活性蛋白质、多肽都是由无活性的蛋白质前体,经过酶的加工剪切转化而来的有共同的来源,相似的结构,保留着若干彼此所特有的生物活性。研究活性多肽结构与功能的关系及活性多肽之间结构的异同与其活性的关系,将有助于设计和研制新的活性多肽药物。多肽药物的种类1、多肽激素2、多肽类细胞生长调节因子3、含有多肽成分的其他生化药物(二)主要多肽类药物的制备1、胸腺素(Thymocln)胸腺激素制剂总的说来都与调节免疫功能有关。(1)结构和性质胸腺素组分5是由在80℃热稳定的40~50种多肽组成的混合物,分子量在1000~15000之间,等电点在3.5~9.5之间。为了便于不同实验室对这些多肽的鉴别和比较,根据它们的等电点以及在等电聚焦分离时的顺序而命名。共分三个区域:α区包括等电点低于5.0的组分,β区包括等电点在5.0~7.0之间的组分,γ区则指其等电点在7.0以上者(此区内组分很少)。对分离的多肽进行免疫活性测定,有活性的称为胸腺素。(2)生产工艺:①工艺路线②工艺过程提取匀浆、离心加热去杂蛋白提取液80℃加热15min,沉淀-10℃丙酮,超滤取分子量在15000以下的超滤液。脱盐、干燥超滤液经SephadexG-25脱盐后,冷冻干燥得胸腺素。(3)检验方法:活力测定:E-玫瑰花结升高百分数不得低于10%;分子量15000以下。(4)作用与用途:为免疫调节剂。2、胸腺肽(Thymuspeptides)(1)结构和性质:胸腺肽中主要是分子量9600和7000左右的两类蛋白质或肽类,氨基酸组成达15种,必需氨基酸含量高,还含有RNA0.2~0.3mg/mg,DNA0.12~0.18mg/mg。对热较稳定,加温80℃生物活性不降低。经蛋白水解酶作用,生物活性消失。(2)生产工艺:①工艺路线②工艺过程超滤、提纯、分装、冻干加3%甘露醇作赋形剂。(3)检验方法:活力测定同胸腺素。分子量10000以下。(4)作用与用途:胸腺肽可调节细胞免疫功能,有较好的抗衰老和抗病毒作用。无过敏反应和不良的副作用。3、降钙素(Calcitonin,CT)(1)结构和性质降钙素是一种调节血钙浓度的多肽激素,由甲状腺内的滤泡旁细胞(C细胞)分泌。是由32个氨基酸残基组成的单链多肽,降钙素肽链的脯氨酸端与生物活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