Megazyme-总淀粉测定试剂盒翻译

Megazyme总淀粉测定试剂盒（K-TSTA04/2009）简介:酸水解法和酶法被广泛的应用于淀粉含量测定,酸水解法仅仅适用于纯净的淀粉样品,应用范围有限。酶法的前处理步骤上有各种变化，经过凝胶、液化和糊精化作用,糊精水解生成葡萄糖,最终以测量的葡萄糖计算淀粉含量。AACC方法76-11特殊之处在于：在高压蒸汽和碱性环境下淀粉糊化成为凝胶，然后再用淀粉葡糖苷酶将淀粉转化为葡萄糖进行测量。AACC方法76-11会低估某些样品的淀粉含量，包括高多糖玉米淀粉和众多的经过加工的谷物产品。今天应用的众多的测定方法都使用了联合处理方法,如在样品处理过程中或直接在淀粉凝胶化后使用耐热α-淀粉酶。对于难凝胶的样品(如高多糖玉米淀粉)使用了氢氧化钠或二甲基亚砜作为溶剂。为确保膳食纤维中的淀粉能够全部溶解，Englyst和Cummings(1988)总结的处理方法中使用了去分支酶,支链淀粉酶。为了测量极端样品得到满意结果，兼顾数量和可靠性，Megazyme提供了一个总淀粉分析试剂盒，基于使用耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶。这一方法已被AOAC和AACC采用(Method76.13)。最近，耐热淀粉酶可在低pH环境下使用。因此，我们更新了我们的总淀粉测量方法加入了这种酶。这一改进的最大益处在于可以在同一pH（pH5.0）条件下进行耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶孵育，简化步骤以及减少麦芽酮糖（抗耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶水解）的产生。另一改进是使用己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/NADP+在D-葡萄糖处理步骤(K-TSHK5)。Megazyme总淀粉分析方法可以测量广泛范围内食品，饲料，植物和谷类产品（自然的或加工的）。对于大多数样品（例如小麦面粉），淀粉可以在100°C抗耐热性淀粉酶处理步骤中完全可溶。包含高水平抗性淀粉（例如高多糖含量玉米淀粉）样品，需要先用冷2MKOH或热DMSO进行预溶解。含可溶性淀粉和糊精的样品，无需进行抗耐热性淀粉酶处理。原理:抗耐热性淀粉酶水解淀粉为可溶性分支麦芽糊精和去分支麦芽糊精。样品中的抗性淀粉可用2MKOH进行预溶解，再用醋酸钠缓冲液进行中和再进行淀粉酶水解。或者用DMSO在100°C进行溶解。淀粉葡萄糖苷酶水解麦芽糊精至D-葡萄糖。D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸脂，释放出(H2O2)，再用过氧化氢酶催化进行显色反应，产生醌亚胺染料。样品包含高水平的D-葡萄糖和麦芽糊精可以在分析前用80%乙醇进行洗涤。单个样品可在70分钟内完成测定。20个样品可在2小时内完成。特异性，灵敏度，线性范围和精确性此试剂盒专用于分析-葡聚糖（包括淀粉，糖原，植物糖原和非抗性麦芽糊精）。最小可区分的吸收值是0.01吸收值范围。这对应于1.0mg的D-葡萄糖（或0.9mg淀粉）/L在最大样品体积1ml。检测极限：2.0mgD-葡萄糖（或1.8mg淀粉）/L，这对应于0.02吸光度区别在最大体积1ml中。此试剂盒在5-100ugD-葡萄糖范围内呈线性。一个样品溶液的重复测定中，吸收值会有0.005至0.010的波动。当样品体积为1ml时，这相当于0.05-1ml/L浓度的D-葡萄糖。如果样品在准备过程中被稀释，结果需要乘以稀释倍数。例如在样品准备时，样品称重，如10g/L，变异范围将在0.02至0.05g/100g。干扰:如果D-葡萄糖的转化在5分钟内完成，不会产生干扰。可以通过加入D-葡萄糖至反应完成后试管内（例如50ug在0.1ml）以检测干扰。可以看到吸光度显著上升。样品内的干扰物质可以通过加入内标进行分析。可以对这标准进行定量校正。样品操作中的损失可以通过在起始步骤中加入D-葡萄糖进行校正。试剂盒成分Megazyme总淀粉含量测定试剂盒提供有足够运行100次试验的试剂,并提供有全部的试验方法:瓶1:耐热α-淀粉酶(10mL,3,000U/mL在CERALPHA试剂中pH6.5;40°C或1600U/mL在CERALPHA试剂中pH5.0;40°C)。稳定性4年,4°C保存。瓶2:淀粉葡糖苷酶(10mL,3300U/mL在可溶性淀粉)（或200U/mL在p-nitrophenylβ-maltoside*，pH4.5，40°C）稳定性4年,4°C保存。完整的分析程序可在获得。瓶3:GOPOD试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液（0.26M，pH7.4），对羟基苯甲酸（0.22M），叠氮化钠（0.4%W/V）稳定性4年,4°C保存。注意：1.如果GOPOD缓冲液存储在-20°C，会形成盐结晶，用双蒸水稀释至1L前必须完成溶解。2.此溶液含叠氮化钠（0.4%W/V），有毒。瓶4:GOPOD试剂酶。葡萄糖氧化酶(12,000U)和过氧化物酶(650U)和4-氨基安替比林（80mg）。冻干粉，稳定性4年,-20°C保存。瓶5:葡萄糖标准溶液（5ml，1mg/mL）在0.2%W/V苯甲酸溶液中。稳定性4年，室温保存。瓶6:标准的玉米淀粉。淀粉含量见标签。稳定性4年,-20°C保存。准备试剂溶液溶液1用试剂1（100mM醋酸钠缓冲液,pH5.0，自备）稀释1.0mL瓶1成分至30mL。分成小份后冻存。稳定性3年,-20°C保存。注意：如果按照AOAC方法996.11（exampleb），用试剂4（50mMMOPS缓冲液,pH7.0）稀释酶。溶液2此酶不用稀释可以直接使用,由于酶溶液具有一定粘稠度,所以必须使用正确的移液器。4°C下保存,稳定性3年。溶液3用蒸馏水稀释瓶3成分（GOPOD试剂缓冲液）到1L,立即使用。溶液4用20ml溶液3溶解瓶4成分再倒回溶液3瓶子。铝箔纸包裹避光。这就是葡萄糖测定试剂(GOPOD试剂)稳定性:4°C下保存，3个月；-20°C下保存，12个月；分装成小份再进行冻存，只能冻融一次。新鲜配制的试剂呈浅黄色或浅紫色。4°C下保存2-3个月过程中，逐渐变成深紫色。用水为空白对照时，此溶液的吸光度0.05。溶液5&6同瓶5&6自备试剂1.醋酸钠缓冲液(100mM,pH5.0)+氯化钙(5mM)5.8ml冰醋酸(1.05g/mL)加入900mL蒸馏水,用1M(4g/100mL)NaOH调节pH到5.0,大约需要30mL。4°C下保存2个月.添加0.74g二水氯化钙完全溶解,定容到1L,4°C下保存6个月。注意：可通过添加叠氮化钠（0.2g/L）增加此缓冲液的稳定性。室温2年。必须在pH调完后再加入叠氮化钠。酸化的叠氮化钠会释放出有毒气体。2.醋酸钠缓冲液(1.2M,pH3.8)69.6ml冰醋酸(1.05g/mL)加入800mL蒸馏水,用4MNaOH调节pH到3.8,定容到1L。室温下保存12个月。3.氢氧化钾溶液（2M）加入112.2gKOH至900mL去离子水，搅拌溶解，定容一升。储存于密闭容器。室温下2年。4.MOPS缓冲液(50mM,pH7.0)+氯化钙(5mM)+叠氮化钠(0.02%)（仅用于exampleb分析样品）11.55gMOPS(钠盐,Sigmacat.M-9381)加入900mL蒸馏水,用1M(10%V/V)HCl调节pH到7.0,大约需要17mL。添加二水氯化钙(0.74g)和叠氮化钠(0.2g),完全溶解,然后调整到1L,4°C下保存6个月。5.醋酸钠缓冲液(200mM,pH4.5)+叠氮化钠(0.02%)（仅用于exampleb分析样品）冰醋酸(11.8mL,1.05g/mL)加入900mL蒸馏水,用1M(4g/100mL)NaOH调节pH到4.5,大约需要60mL。加入叠氮化钠(0.2g),完全溶解,然后调整到1L,4°C下保存6个月。注意：可通过添加叠氮化钠（0.2g/L）增加此缓冲液的稳定性。室温2年。必须在pH调完后再加入叠氮化钠。酸化的叠氮化钠会释放出有毒气体。设备:1.玻璃试管(圆底;16x120mm或18x150mm)2.离心机(3,000rpm)3.微量移液器(100uL).4.连续分配器5.分析天平.6.分光光度计510nm.7.漩涡混合器8.定时钟9.沸水浴锅和试管夹注意事项:1.GOPOD试剂的孵育时间没有严格规定,但是至少要20分钟,并在60分钟内测定吸光度.2.每次试验必须设定试剂空白对照和葡萄糖对照(100μg,四倍)。a)试剂空白对照:0.1mL蒸馏水+3.0mLGOPOD溶液b)葡萄糖对照包括:0.1mL葡萄糖标准溶液(100μg/0.1mL)+3.0mLGOPOD溶液。因子F（页码13和14）通过D-葡萄糖在标准分析中读得的吸光度进行计算（例如100/1.038=96.386）。3.每次试验必须设定标准面粉或淀粉样品4.每一新批此的GOPOD溶液,必须验证其与100μg葡萄糖标准反应产生颜色所需要的最长时间,通常为15分钟左右。样品空白:样品空白按照标准试验程序（exampleA）进行,将第4步修正为添加3mL蒸馏水,第5步中也用蒸馏水替代其中的淀粉葡糖苷酶.也可以用样品前处理中所用的酒精作为样品空白(exampleE)。样品准备示例A.不含抗性淀粉，D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物（建议的程序，pH5.0孵育）。1.研磨谷物,过0.5mm筛（35目）。2.将研磨后样品(准确称量~100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v)湿润样品帮助分散,用漩涡混合器混合。4.立即加入3mL耐热α-淀粉酶(100mM醋酸钠稀释),在沸水浴中孵育6分钟(在孵育2分钟,4分钟，6分钟的时强烈振荡试管).注意:在这一步中强力震荡是关键，目的是确保浆状样品能完全的混匀（去除块状）。同样,每间隔2分钟振荡也是为了防止由于酒精蒸发导致某些样品被喷出试管。如果使用聚丙烯管，增加孵育时间至12分钟，在4,8和12强烈震荡。5.将试管放置于50°C的水浴锅中,加入0.1mL瓶2成分（淀粉葡糖苷酶,330U在淀粉上）。充分混合,在50°C下孵育30分钟。6.将全部的溶液转移到100mL的容量瓶中,用洗瓶冲洗试管,并也倒入容量瓶中,然后用蒸馏水调整溶液体积,充分混匀。取部分溶液离心(3,000rpm,10分钟)。取清澈的未稀释的上清用于分析。注意：对于含有1-10%淀粉的样品,在第6步中用蒸馏水调整溶液至10mL,充分混匀,离心(3,000rpm,10分钟),该溶液可以直接进行第7步.对于含10-100%淀粉的样品,用蒸馏水稀释1.0mL样品液到10mL再进行第7步。7.转移两份稀释的样品溶液(0.1mL)到园底试管中(16x100mm)。8.加入3.0mLGOPOD溶液到每一个试管中(包括葡萄糖对照和试剂空白对照),然后在50°C下孵育20分钟9.葡萄糖对照包括0.1mL葡萄糖标准溶液(1mg/mL)+3.0mLGOPOD溶液。试剂空白对照:0.1mL蒸馏水+3.0mLGOPOD溶液10.相对于试剂空白在510nm下测定每一个样品和葡萄糖质控的吸光度。B.不含抗性淀粉，D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物（AOAC996.11）。1.研磨谷物,过0.5mm筛（35目）。2.将研磨后样品(准确称量~100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。3.加入0.2mL乙醇溶液(80%v/v),用漩涡混合器混合。4.立即加入3mL耐热α-淀粉酶(50mMMOPS稀释),在沸水浴中孵育6分钟(在孵育2分钟,4分钟，6分钟的时强烈振荡试管).注意:在这一步中强力震荡是关键，目的是确保浆状样品能完全的混匀（去除块状）。同样,每间隔2分钟振荡也是为了防止由于酒精蒸发导致某些样品被喷出试管。如果使用聚丙烯管，增加孵育时间至12分钟，在4,8和12强烈震荡。5.将试管放置于50°C的水浴锅中,加入醋酸钠缓冲液（4ml，200mM，pH4.5），加入0.1mL瓶2成分（淀粉葡糖苷酶,20U）。充分混合,在50°C下孵育30分钟。6.按照exampleA步骤6继续实验。C.含抗性淀粉，不含D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物（建议KOH溶解）1.研磨谷物,过0.5mm筛（35目）。