我国植物细胞和组织培养、苗木脱毒快繁和细胞工程育种及其产业化

我国植物细胞和组织培养、苗木脱毒快繁和细胞工程育种及其产业化和专利保护徐涵1*，黄先群2，连勇31法国图卢兹综合科学研究所IRIT-ARI,31300Toulouse,France.2贵州省农业生物技术重点实验室,贵州，贵阳，小河，金竹，550006.3中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京，100081摘要：本文简要论述了我国植物细胞和组织培养、苗木脱毒快繁和细胞工程育种及其产业的发展状况，并对我国自1985年实施专利保护起至2008年期间的相关专利数据进行了分析。关键词：植物组织培养育种专利知识产权PlantCellandTissueCulture,Virus-FreePropagation,Cell-EngineeringBasedBreedingandTheirIndustrializationandPatentProtectioninChinaXuHanXu1*HuangXian-Qun2LianYong31IRIT-ARI,202BisRuedesFontaines,31300Toulouse,France.2GuizhouProvincialAgro-BiotechnologyKeyLaboratory,Jinzhuzhen,Guiyang,Guizhou,550006,China.3InstituteofVegetablesandFlowers,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing,100081,ChinaAbstract:Plantcellandtissueculture,largescalepropagationofvirus-freeplants,cell-engineeringbasedbreedinghavebeenwidelyappliedinChinaandhaveachievedmanyinimprovingsurvivalsituationsofplants,animalsandhumanbeings,aswellaspromotingsocialdevelopment.Morethanseventhousandbio-R&DenterprisesaredevelopinginChina.ThepresentpaperpresentsandanalysespatentdataoftheaboveR&Ddomainsfromyear1985，whenChinapatentlawcameintoeffect,toyear2008inChina,andsuggeststoaddressmoreeffortstonovelfrontierofR&D,andprotectionofintellectualpropertyrights.Keywords:plant,tissueculture,breeding,patent,intellectualpropertyrights*通讯作者：徐涵，法国图卢兹综合科学研究所（IRIT-ARI），博士，研究员。E-mail:[e-mail]黄先群，贵州省农业生物技术重点实验室，博士，研究员。E-mail：[e-mail]连勇，中国农业科学院蔬菜花卉研究所研究员。E-mail：[e-mail]．4．植物细胞与组织培养技术研究植物组织培养技术是指在无菌条件下，将植物体器官、组织、细胞以及原生质体培养在人工配制的培养基上，给予适当条件进行培养，使其产生完整植株的过程，主要包括高效再生体系建立（无性系快速繁殖）、胚和子房培养、花药和小孢子培养、原生质体或细胞培养及体细胞杂交等1。目前我国植物细胞和组织培养，包括体细胞杂交、单倍体育种、无融合生殖等技术等细胞工程育种技术体系，以及苗木脱毒、快繁产业化已经在生物科学研究和农、林、园艺等产业中日臻完善，产生了巨大的社会和经济效益，许多领域已经把从资源到产业化乃至社会发展有机地贯穿起来[]2。1.植物组织培养、苗木脱毒快繁产业化和细胞工程育种研究及产业化1.1.植物种质资源保存无性系快速繁殖主要是利用植物的子叶、下胚轴、苔茎段、茎尖以及叶片等器官作为外植体，通过离体培养方式进行无性繁殖，在短期内获得大量再生株系的技术。这个技术可以用来快速繁殖某些特殊个体，如新发现的突变材料、远缘杂种、体细胞植株、转基因植株[,]34等供研究、育种和生产之用，也可以用作植物资源的离体保存或大量繁殖，从而实现种质保存[,]56。我国地域辽阔、生态环境多样化，形成了适应特殊条件的众多特有生物物种的生境，蕴藏着一大批对解决我国环境恶化、食物与健康安全和能源资源短缺等问题有重要利用价值的特殊生物资源。从20世纪50年代以来，我国已收集和抢救了一批珍稀、特有和濒危的生物资源，但一直存在利用效率偏低、流失日趋严重、掠夺式的开发造成资源的迅速濒危或灭绝等问题。《中国物种红色名录》[]7对中国102l1种动植物(其中动物5803种、植物4408种)的灭绝危险程度进行了新的评估。评估表明，中国的物种濒危情况远比过去评估的比例高，各类生物物种受威胁的比例普遍在20％～40％，如裸子植物受威胁（极危、濒危和易危）和近危的比例分别为69.91%和21.23%，被子植物分别为86.63%和7.22%。因此，利用无性繁殖作物种质资源保存，尤其是对于一些濒危或用种子繁殖有困难的植物品种，组织培养无疑是实现快速、有效、大量繁殖的最佳选择。用组织培养技术进行植物种质保存有两种方法：一种是在培养基中加入生长减速剂或者降低培养温度来抑制细胞生长，使培养物的分化代谢活动减弱，加长继代周期，以保存种质[]8。另一种是超低温的种质保存。超低温的种质保存是将植物细胞或组织保存在液氮中，让细胞的代谢活动完全停止，但同时还保持细胞的生命力和再生能力的一种种质长期保存方法[,]910。采用植物细胞、组织或器官离体保存，能最大限度地抑制生理代谢强度，达到长期保存种质的目的。这方面代谢的研究很有价值，因为即使是在同一个种内，不同的基因型以及不同保存条件下其代谢是不同的[8]。无性系繁殖技术还应用到对远缘杂交种胚的挽救和繁殖。远缘杂交是获得新的基因资源、改善植物品质和抗性的重要途径。植物种间、属间常规杂交的杂种胚，有的在心形期或球形期便解体，多表现不育、败育或种子无发芽力，难以获得有效种子。子房、胚珠和胚培养是将发育不良或不能发育的胚（胚珠）接种到培养基上，在人工条件下培养，让其发育成成熟胚或有效种子的技术，这是克服远缘杂交时胚发育不良或败育的有效手段之一[]11。利用这项技术已培育出一批品种在生产上应用。同时，其在种子繁殖不易的植物上有广阔的应用空间[]12，在植物极幼胚培养方面仍然需要大量的研究[]13。1.2．植物脱毒、快繁技术及工厂化生产种苗病毒是威胁植物品质和产量的主要问题之一，目前仍然没有特效防治药物。病毒主要通过媒介昆虫或其他原因造成的植物根、茎、叶损伤入侵植物体。在植物细胞中繁殖的病毒还可以不断感染其相邻的细胞，最终扩散至整个植株。但是，发育旺盛的植物分生组织的生长点细胞一般不含病毒。切取生长点细胞，放入试管培养并使之分化，可以获得无病毒的植株,利用快繁技术使这些无病毒细胞繁我国植物细胞和组织培养、苗木脱毒快繁和细胞工程育种及其产业化和专利保护．5．殖、分化，最终便能够达到工厂化大量繁殖无毒植株的目的。马铃薯、大蒜、甘薯、草莓及许多果树和花卉，由于多代营养繁殖，植株体内积累了大量的病毒，种性退化严重，表现为作物生长受到抑制，形态畸变，产量下降，品质变劣等等。而利用茎尖组织培养辅以化学或高温处理，可以较好地起到植株脱毒作用，培养出来的种苗称作脱毒苗。大蒜经组培脱毒后，蒜头可增产23.3%～114.3%，蒜薹增产58.3%～175.0%；用脱毒草莓苗进行生产，可提高果实产量20.7%～45.5%，果实可溶性固形物含量增加5.3%～15.3%。应用最为成功的例子是马铃薯脱毒种薯的生产[]14。由于植物生长点外围的细胞也有可能被病毒感染，上述脱毒过程有时需要重复多次之后方能得到完全无病毒的植株。目前植物脱毒也在使用其他方法，如液氮法[]15。在上世纪60年代，随着无病毒兰花植株快速繁殖的成功，在国际上逐渐建立起试管苗工业，无病优质种苗的生产已广泛应用于花卉和蔬菜。在1980s年代中期，除了马铃薯无毒种薯和甘蔗种苗生产之外，我国在这方面的研究还只停留在实验室阶段。随后10年间，我国脱毒结合快繁技术成效显著，香蕉、柑桔、苹果、葡萄、山葡萄、草莓和西瓜的试管苗已经在生产上大规模推广；菊花、香石竹和唐葛莆的无毒种苗的生产技术已基本完善，一些花卉和观叶植物也开始了商业化生产。除了果树外，快速繁殖技术在林木、蔬菜和药材等方面也取得了很大的发展和效益；造林树种如桉树也已经建立起试验苗基地。在热带和亚热带果树中，还扩展到荔枝、龙眼、柚子、芒果和菠萝；在温带水果中，除苹果、葡萄和草莓外，还对梨、枣、樱桃、山楂、柿子和猕猴桃进行了研究。现在国内外植物快繁技术在实验层面上已经全成熟，其经专业化和工程配套后广泛运用于花卉、果树的种苗培育，主要涉及兰花、非洲菊、唐菖蒲、菊花、香石竹、火鹤花等十多个花卉品种及香蕉、柑桔、苹果、葡萄、马铃薯、甘薯、草莓无毒苗生产。目前已从各类植物的不同器官和组织中建立了快繁体系。在育种中，应用最成功的例子除了马铃薯脱毒苗原原种的生产外，在花卉、香蕉、甘蔗、桉树等的工厂化育苗和生产，以及资源库中材料的保存等方面也已取得巨大的经济和社会效益。在我国试管苗年产量几亿株，除了维持传统的脱毒作物种子生产外，还使一些花卉和林木优良品种的脱毒苗产量迅速扩大。对于那些珍贵稀有、濒临灭绝、特种资源、常规繁殖困难、市场需求量大而一直供不应求的植物而言，植物快速繁殖技术显示出巨大的优越性[,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,]1617181920212223242526272829303132333435。植物脱毒、快繁技术的理想体系之一是体细胞胚胎发生系统。它是把体细胞诱导成合子状胚性细胞，并调控使之像有性的合子胚胎发育那样产生体细胞胚胎[，]3637。这一系统在许多模式和有经济价值的植物物种上已经成功地建立起来。人工种子是其产业化的主要出路。植物快繁技术中一些控制条件和细化的研究还有待完成[,,,,]3839404142。植物组织培养的另一个应用领域是嫁接（包含微嫁接）。由于实用这项技术可以节省几年甚至几十年的育种时间，它在木本植物上有更高的实用价值[，]4344。植物脱毒、快繁技术还受其他条件的影响和限制，相关的技术研究和技术熟化研究在产业化方面占有重要的位置[，]4546。1.3.植物单倍体及无融合生殖育种技术利用植物染色体变异进行育种是植物改良的重要手段[]47。这方面同时包括两个极端，既包括倍性的改变又包括倍性的稳定乃至基因组的稳定。由花药、小孢子或胚囊培养为基础的单倍体育种能加速育种进程、节约劳力和时间、提高选择效率，现已纳入常规育种技术而广泛应用。例如，来源于油菜小孢子和花药培养的再生胚状体，其芥酸和硫代葡萄糖甙的生物合成水平同其在种子中的含量成正相关，因此，在离体培养的早期即可筛选低芥酸、低硫代葡萄糖甙（称“双低”）的基因型，再结合传统育种手段可获得双低油菜品种或品系。利用该技术选育的“双低”油菜品种可增产7%～11%。此外，利用小孢子培养技术产生的双单倍体群体．6．植物细胞与组织培养技术研究还可用来构建遗传图谱、基因定位等[]48。单倍体育种技术在马铃薯、小麦等其他作物上也大量应用[,,]495051。无融合生殖是指不经雌雄配子融合的受精作用而形成有活力的胚和种子的生殖方式，后来只限定为发生在胚珠内的不经受精作用而产生种子(无融合结籽)的生殖方式。它包括从减数胚囊中发生的单倍体无融合生殖(孤雌生殖、无配子生殖和单雄生殖)和从未减数胚囊中发生的二倍体无融合生殖(无孢子生殖、二倍体孢子生殖)。单倍体无融合生殖产生的胚一般是不育的,但其后代染色体经人工或自