原核蛋白表达与纯化

ThekeyofProkaryoticproteinexpressionandpurification北京全式金生物技术有限公司☏：400-898-0321•原核表达概述•原核表达策略选择•表达结果验证•常见问题与实验例上篇原核表达原核表达原理概述表达载体表达菌株表达条件原核表达概述原核表达原理概述表达载体目的基因重组载体表达菌株“基因——载体——菌株——培养”培养，诱导构建转化表达载体•启动子•融合标签•常用表达载体系统常见启动子•λpL启动子：热诱导启动子•trp启动子：化学诱导启动子•trc启动子：trp+lac杂交启动子•tac启动子：trp+lacUV5杂交启动子；pGEX（Pharmacia）、pMal（NEB）•T7/T7lac启动子：pET（Novagen）、pEASY-E1/E2（Transgen）T7启动子T7lac启动子融合标签•常用于蛋白检测与纯化。•有时也可增加蛋白可溶性、将蛋白运转至特定位置。N端融合：易于构建。终止密码子来自载体/基因表达量高提前终止会干扰纯化二级翻译起始不影响纯化C端融合：构建时注意避免移码基因不能自带终止密码子提前终止不影响纯化二级翻译起始会干扰纯化常用融合标签•His·TagpET系统•GST·TagpGEX系统•MBP·TagpMal系统系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEXGE(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck(Novagen)T7T7lacAmpKanHis·Tag种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系统常用表达载体系统表达菌株考虑因素细胞特性蛋白稳定性蛋白酶缺陷型——B型菌株，缺失lon、ompT蛋白酶多种常用表达菌株均为此类，如BL21、Origami、Rosetta等启动子tac启动子需要大肠杆菌自身的RNA聚合酶即可：BL21T7启动子需要能够提供T7RNA聚合酶的细胞：DE3溶源菌抗性细胞不能与载体带有相同的抗性：pET-28a+OrigamiB(DE3)No！pET-21b+OrigamiB(DE3)Yes！严谨调控BL21(DE3)pLysS/BL21(DE3)pLysE稀有密码子Rosetta系列溶解性Origami系列稀有密码子不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基因的mRNA无法正常在E.coli里表达，是为“稀有”密码子。表达条件•乳糖操纵子与诱导物•常用表达条件的优化乳糖操纵子与诱导物•1980年，GuaranteL等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统GuaranteL,RobertsTM,PtashneM.Atechniqueforexpressioneukaryoticgenesinbacteria.Science,1980,209:1428~1430•启动子Plac+操纵基因lacO+结构基因•lacI负调控：阻遏物lacI与操纵基因lacO结合，抑制表达IPTG：半乳糖苷类似物，结合阻遏物lacI使其失活，启动诱导表达•cAMP-CAP正调控cAMP结合并激活CAP，起始转录，实现正调控葡萄糖抑制腺苷酸环化酶，ATP不能转化为cAMP，无cAMP-CAP，无转录常用表达条件的优化•培养基组分•温度•IPTG浓度•OD值•培养体积与溶氧量根据实验目的选择表达策略载体选择感受态细胞选择表达条件原核表达策略选择根据实验目的选择表达策略1.明确实验目的2.选择表达载体3.选择表达菌株4.优化表达条件实验目的表达策略活性分析可溶表达制备抗原包涵体高纯度融合标签结构研究天然蛋白…………选择表达载体系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEXGE(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck(Novagen)T7T7lacAmpKanHis·Tag种类丰富。标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系统选择表达菌株菌株适合启动子特性BL21tac、trc……(pGEX、pMal)适用于非T7启动子的表达系统BL21(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)适用于T7、T7lac的表达系统，适用于非毒基因的表达BL21(DE3)pLysST7/T7lac(pET，pEASY)质粒pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，可结合T7RNA聚合酶，降低本底表达水平。适用于严谨调控毒基因的表达Rosetta(DE3)Transetta(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)补充6种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平OrigamiB(DE3)TransB(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)具有thioredoxinreductase/glutathionereductase双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。毒基因：基因表达产物——即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性”）PageDownPageUpBL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE利用T7溶菌酶的严谨调控机制优化表达条件葡萄糖：抑制cAMP形成，进而抑制表达，严谨调控无其他严谨调控手段（pLysS）且毒基因时，至关重要！温度：影响表达速率、蛋白可溶性与活性IPTG浓度：影响表达速率、蛋白可溶性与活性lac透性酶(lacY1)突变使IPTG均一渗透，获得浓度依赖的诱导：Tuner，OrigamiB，Rosetta其他因素：菌体密度Mg2+培养体积与通气……ArtMediaTMProteinExpression（AMPE）•葡萄糖抑制cAMP形成，无cAMP-CAP，不能正调控乳糖操纵子，因而无法利用乳糖，使得大肠杆菌优先利用葡萄糖•AMPE中含有特定配比的葡萄糖与乳糖，利用该机理，使得葡萄糖耗尽开始摄入乳糖时，控制细菌恰好生长到适合诱导的阶段（对数期），利用乳糖代谢，启动自动诱导！•无需监控菌体生长，实现自动诱导•无需加入IPTG，对细菌生长无抑制•细胞密度高，蛋白产量高•应用于一切乳糖操纵子表达系统：pET、pGEX、pMal、pEASY……4123pET28a,30kDa1：ArtMedia2：LB3：LB+0.2%Glucose4：SOB载体：pEASY-E1蛋白：70kDa菌株：Transetta(DE3)Lane1:LB培养基，对照Lane2:LB培养基，IPTG诱导Lane3:AM-PE自动诱导载体：pGEX-5X-3蛋白：70kDa蛋白：30kDa菌株：BL21Lane1:LB培养基，IPTG诱导Lane2:AM-PE自动诱导Lane3:LB培养基，对照123123表达定位表达结果验证溶解性信号肽活性免疫原性产量纯化难度胞内表达可溶/包涵体不需要有/无有最高≤50%蛋白种类多，需裂解菌体，复杂周质表达多为可溶需要有有较少≤4%蛋白种类少，需渗透压休克，相对容易胞外分泌完全可溶需要有有变化较大纯化简单。但机理不详，成功先例少表面展示融合膜蛋白/嵌合于膜上需要-有-适用于疫苗开发、抗体制备，前景广阔。表达定位菌液离心菌体细胞总蛋白培养基组分悬菌，渗透压休克菌体细胞周质组分悬菌，裂解，离心胞质可溶组分沉淀溶解，离心胞质不溶组分沉淀沉淀上清全菌可溶表达沉淀上清全菌包涵体常见问题与实验例无表达或表达量低蛋白不可溶蛋白纯化障碍无表达或表达量低•载体-菌株搭配不当•摸索最佳的组合载体启动子菌株pGEXtacBL21pMaltacBL21pETT7/T7lacBL21(DE3)BL21(DE3)pLysSRosetta(DE3)OrigamiB(DE3)pEASYT7lac同上无表达或表达量低稀有密码子•影响：翻译终止，移码突变，氨基酸序列错误，表达量低或无表达•应对：在宿主中补充稀有密码子的tRNARosetta系列菌株（Novagen公司）1：BL21(DE3)；2：Rosetta(DE3)；3：BL21(DE3)pLysS目的蛋白M123无表达或表达量低毒基因•影响：宿主中质粒不稳定、抑制生长或杀死宿主（溶菌）、表达量低或无表达•应对：严谨调控启动子，抑制本底表达选择特殊的载体（pETcoco）选择特定的宿主菌（BL21(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysE）优化培养条件与诱导表达条件包涵体表达123pET28aLane1：Rosetta(DE3)Lane2：BL21(DE3)pLysSLane3：BL21(DE3)蛋白不可溶•成因：蛋白质正确折叠，形成有活性、有功能的天然构象的程度。•定位：可溶蛋白胞质，细胞周质，胞外（培养基）包涵体胞质，细胞周质•特点：可溶蛋白天然构象，正确折叠，具有生物活性包涵体高浓度，高纯度，无活性，具免疫原性，不易水解增加可溶表达原理手段促进正确折叠融合催化二硫键形成酶的标签选择促二硫键形成的细胞（Origami系列菌株）分泌表达细胞周质表达，胞外分泌融合表达融合溶解性高的标签（GST，MBP）控制表达水平诱导温度IPTG浓度“假”包涵体（疏水区域，膜结合等）特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶……）123Lane1：37℃Lane2：30℃Lane3：25℃12pETpGEX促进包涵体形成•目的高浓度，高纯度毒基因表达免受蛋白酶水解（小蛋白，多肽）•手段胞质表达提升表达速率（诱导温度，IPTG浓度，etc）特定的表达载体（pET-17xb，pET-31b(+)）蛋白纯化障碍•表达——纯化是一个完整的、密切联系的过程，蛋白纯化过程中，很多问题的根源来自上游表达•蛋白不结合，洗脱杂带多，包涵体不易溶解……•下篇详述•纯化策略选择•亲和层析与离子交换层析•层析方法的组合与顺序•包涵体纯化与复性下篇蛋白纯化根据蛋白自身特点选择纯化方案常用实验流程纯化策略选择蛋白自身特点•可溶/包涵体•融合标签•表面净电荷•分子量•其它特点可溶/包涵体可溶蛋白•无需变性步骤•适用于亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法包涵体•需要洗涤、变性、复性（如有需要）等步骤•适用于某些亲和层析方法（6×His·Tag）、离子交换层析•不适用于某些亲和层析方法（GST·Tag、MBP·Tag）•不适用于凝胶过滤层析等方法融合标签6×His·TagGST·TagMBP·Tag标签大小6aa26kDa42kDa原理金属螯合层析酶-底物特异结合酶-底物特异结合溶解性可溶/包涵体有助可溶表达有助可溶表达纯化条件天然/变性条件下纯化仅天然条件下纯化仅天然条件下纯化洗脱条件咪唑，低pH还原型谷胱甘肽麦芽糖是否去除通常不需要依实验目的而定依实验目的而定表面净电荷与蛋白质等电点、溶液pH值密切相关离子交换层析的重要标准分子量天然构象下，蛋白分子正确折叠，近似球形，大小与分子量成正比凝胶过滤层析的重要标准其他特点利用蛋白质本身的特点进行亲和层析耐热蛋白可用热变性法进行纯化常用实验流程•菌体裂解•蛋白预处理•层析纯化菌体裂解冻融去垢剂溶菌酶超声破碎原理冰晶+溶胀化学酶解细胞壁机械作用优点简便温和温和彻底打断分子（DNA）缺点活性略有损伤容易起泡需要合适条件伤害活性发热避免蛋白质降解•低温•蛋白酶抑制剂蛋白质预处理(可溶)初分离/粗纯•DNA去除•热变性（对耐热蛋白）交换Buffer•(NH4)2SO4沉淀•透析蛋白质预处理(包涵体)•洗涤•变性溶解13