HPLC色谱柱维护指南

色谱柱维护指南2015年版内容包括：• 流动相限制• 色谱柱贮存建议• 色谱柱保护设备美国制造商色谱柱维护指南目录色谱柱维护和使用简介 1-4选择正确的管路和接头色谱柱安装第一章、硅胶和TWIN™TECHNOLOGY色谱柱 4-7运行参数色谱柱平衡流动相注意事项色谱柱贮存固定相注意事项色谱柱清洗程序柱压和流速 第三章、超临界流体色谱（SFC） 11运行参数清洗程序平衡色谱柱色谱柱贮存流动相注意事项第四章、AXIA制备色谱柱 11-12运行参数清洗程序流动相注意事项色谱柱贮存第五章、LUX手性色谱柱 12-13运行参数延长色谱柱寿命和重新平衡流动相注意事项色谱柱贮存第六章、CHIREX手性色谱柱 13运行参数流动相注意事项第七章、BIOSEP和YARRA体积排阻（SEC）色谱柱14运行参数流动相注意事项清洗程序色谱柱贮存第八章、REZEX聚合物色谱柱 14-19运行参数流动相注意事项清洗程序规格表和操作参数第九章、POLYSEPGFC-P高聚物色谱柱 （凝胶过滤色谱） 20运行参数流动相注意事项清洗程序色谱柱贮存第十章、PHENOGELGPC色谱柱 （凝胶渗透色谱） 21,24-25规格溶剂切换注意事项样品注意事项溶剂互溶表色谱柱贮存溶剂互溶表 22-23第十一章、POLYMERXRP色谱柱 26规格清洗程序运行参数色谱柱贮存流动相注意事项第十二章、HPLC色谱柱维护和 性能测试 26-37第十三章、样品瓶 38第十四章、固相萃取(SPE) 40第十五章、HPLC配件 41PHENOMENEX保证条款 42第二章、ONYX硅胶整体柱7-10运行参数色谱柱平衡清洗和再生程序色谱柱贮存流动相注意事项固定相注意事项硬件注意事项 色谱柱安装1简介每根PhenomenexHPLC色谱柱都极其精密、复杂且脆弱，但只要维护得当，就能带来卓越的性能、重现性和色谱柱寿命。本手册中所包含的信息与建议旨在为您的色谱柱维护和使用提供指导，请根据实际情况加以参考。请按照本文中的说明来尽可能发挥色谱柱的性能并延长其使用寿命。如果有任何疑问，请联系您的Phenomenex技术顾问或当地经销商。收到色谱柱时 ：• 核实收到的色谱柱是否与订购的色谱柱相符• 检查色谱柱在运输途中是否受到物理性损坏• 立即测试色谱柱以验证其性能和质量• 除非另有说明，所有色谱柱在运输途中均贮存在测试溶剂中Phenomenex生产的每根HPLC色谱柱均独立填装并经过测试，以确保色谱柱的高品质。每根色谱柱均随附其测试色谱图和说明书，其中指明了色谱柱的序列号和产品类型、测试条件以及操作参数。保修期自色谱柱收货之时开始计算。如果需要贮存色谱柱而不是立即使用，测试特别重要。请在与测试色谱图相同的条件下测试色谱柱。使用图1中的公式来确定色谱柱柱效和峰不对称性。色谱性能取决于整个系统而不单单是色谱柱。色谱柱是在优化条件下进行QC测试，以尽可能消除“柱外效应”带来的谱带展宽。如果测试结果与PHENOMENEX数据相异，大多数是因为由于系统设计带来的柱外效应所致（例如 ： 进样器、流通池、管路等）。如果您对测试结果或色谱柱质量有任何疑问，或者色谱柱有任何损坏的迹象，请立即联系PHENOMENEX或您的当地经销商。图1半高峰宽(W½)是峰高一半处的实际宽度保留时间：不保留峰峰不对称性色谱柱柱效峰1峰2tO1R1tR1tR2As切线用于确定底部峰宽(W)AWBW1/2进样BA5.542N==W½W½10%峰高A=峰从10%峰高处到垂线B=垂线到峰尾10%峰高处()柱效和峰不对称性的计算公式©2015Phenomenex,Inc.版权所有。2选择正确的管路和接头HPLC系统上的管路和接头会影响到系统死体积。如果不减少死体积，则死体积会导致谱带展宽和峰变形。请按照以下指南来尽可能降低系统死体积，同时确保达到最佳的色谱柱柱效。管路管路的选择应考虑其耐化学腐蚀性、应用以及HPLC系统的注意事项（例如：流速、柱压等）。相关细节请参见表1-3。管径表1高压管路：1/16英寸外径x0.010英寸内径入口/出口低压管路：1/16英寸外径x0.030英寸内径1/8英寸外径x0.062英寸内径管路兼容性表2不锈钢（316型）避免接触高浓度 酸或卤化物PEEK （生物兼容性）避免接触100%THF、 氯化溶剂、高浓度酸钛 （生物兼容性）几乎与所有化学物质兼容管路应用表3管路内径（英寸）色谱柱内径 (mm)典型流速（mL/min）0.0020.30（熔融石英）0.001-0.020.0051.0（不锈钢）0.02-0.10.0072.0-4.60.2-2.00.0103.2-7.80.5-5.00.02010.0-21.22.0-50.00.04021.2-100.010.0-200.03安装注意事项：•各家制造商的扣压卡套具有不同的形状。对于Phenomenex色谱柱，您可以使用Phenomenex或Valco型卡套。•非常重要： 对于Phenomenex色谱柱，管尖的插入深度 （图2）为0.080英寸。管路必须完全插入色谱柱的柱端接头，否则会在色谱柱的顶部或底部形成一个小的混合腔。这会降低色谱性能。 *聚合物手紧接头易于使用。它们采用一体化设计，无需工具即可安装，并可随色谱柱柱端接头的形状而随意变化。卡套32螺纹/英寸10号或0.190英寸直径阳螺母1/4英寸外径标准分析（250x4.6mm内径）1/16英寸外径管路（0.010英寸内径）阴/反向（内螺纹）色谱柱柱端接头10-32螺纹阳螺母和卡套管尖的插入深度至关重要聚合物 手紧阳螺母接头所有Phenomenex色谱柱端接头均为10-32螺纹的反向阴接头（内螺纹）：•柱端接头适用于任何1/16英寸外管路（有关管路的注意事项，请参阅第2页。）•使用10-32螺纹阳螺母和卡套或聚合物手紧阳螺母*将管路连接或固定到接头上（请参阅图2）图2图34色谱柱安装强烈建议您在安装之前阅读指南中的特定色谱柱注意事项（第一至十一章）•用过滤并脱气的流动相（不含任何缓冲液）彻底冲洗HPLC泵和管线。确保系统中没有气泡。•按照流向标签（位于色谱柱上）指示的方向将色谱柱连接至进样器。不要连接色谱柱的出口。•将泵流速设置为0.1mL/min（或最低设置）并在5分钟内增大至正常流速。•当色谱柱出口处有溶剂自由流出时停止泵送，擦拭出口端并将其连接到检测器。•以正常流速和约10-30倍色谱柱体积的流动相来平衡色谱柱。•对于可在反相或正相条件下（例如：-CN或-NH2 ）使用的色谱柱，从反相转换为正相模式前，请用20-30倍色谱柱体积的IPA或THF作为中间溶剂进行 冲洗，反之亦然。第一章、 硅胶和 TWIN™TECHNOLOGY色谱柱运行参数•除非另有说明，所有多孔硅胶和TWINTechnology色谱柱应将柱压限制在3500psi（245bar）以下。对于可能超过该压力的应用，请咨询Phenomenex技术顾问，以了解有关特定方法的注意事项。本章介绍的指南还适用于高速技术（HST）硅胶色谱柱。有关详细的UHPLC操作建议，请参阅核-壳色谱柱指南。•避免任何突然的压力变化。•如果观察到高柱压，请反冲色谱柱（请勿对其他制造商的色谱柱尝试此方法）。•如果检测池内出现漏气问题，请使用柱压调节器。•除非另有说明，所有硅胶色谱柱的最高操作温度为60°C。对于特定的核-壳和聚合物色谱柱，请参阅特定指南或联系Phenomenex技术顾问，以了解有关特定方法的注意事项。流动相注意事项•仅使用HPLC色谱纯溶剂和水•仅使用最高纯度的化学品和试剂•使用前要对所有流动相进行过滤和脱气•确保溶剂可互溶微量杂质会显著削弱HPLC色谱柱的效果。在更换至不同的流动相时，请确保溶剂和/或缓冲液可互溶（请参阅表11）。使用与色谱柱中溶剂不互溶的溶剂会对色谱柱造成永久性损坏。流动相中的盐和缓冲液沉淀物会对色谱柱造成永久性损坏。始终检查样溶解度，如果可能，请使用流动相作为稀释剂（样品溶剂）。固定相注意事项•保持pH值在2.0和8.0之间*•使用预饱和色谱柱和保护柱•避免对氨基柱使用醛类和酮类化合物硅胶色谱柱对pH值敏感。低pH值(2.0)会水解键合相 （官能团解离），而高pH值(8.0)又会溶解硅胶。如果流动相的pH值接近2.0或8.0，那么请使用预饱和色谱柱。*有关宽pH范围的色谱柱，请咨询Phenomenex技术顾问。5柱压和流速此表是在对以下粒径和规格进行QC测试时，观察到的典型柱压。表4 粒径(μm) 内径(mm) 典型流速 典型柱压(psi) （mL/min） 150mm* 250mm* 1.7 I 2.1 I 0.3 I 6700 I 不适用 2.6 2.1 0.2 6400 不适用 2.6 3.0 0.8 5500 不适用 2.6 4.6 1.85 5000 不适用 3 2.0 0.2 1500 2400 3 3.0 0.3 1500 2400 3 4.6 0.75 1500 2300 5 2.0 0.2 650 1000 5 3.0 0.5 900 1400 5 4.6 1.0 850 1200 10 10.0 5.0 900 1000 AxiaLuna 21.2 20.0 350 500*色谱柱长度色谱柱可以在与前面所介绍的柱压限制内的任何流速下操作。建议优化流速，使您的样品能获得最佳柱效。比例放大/比例缩小根据不同色谱柱内径调整流速十分简单。要让保留时间保持不变，就必须根据色谱柱的内径来调整流速和载样量。假定色谱柱长度不变：X=比例因子=（B色谱柱半径）2（A色谱柱半径）2对于4.6mm内径色谱柱，部分比例因子包括：表5内径比例因子1.0mm0.05x2.0mm0.2x3.0mm0.5x10.0mm5x21.2mm21x使用无水易燃有机溶剂的HPLC色谱柱（例如：正相、手性、GPC）会产生静电，因此要正确接地以避免发生放电。色谱柱贮存•色谱柱的贮存条件会影响色谱柱寿命•切勿使用缓冲液或离子对试剂贮存色谱柱•用5倍色谱柱体积的流动相（无缓冲液）进行冲洗以去除任何缓冲液或盐硅胶HPLC色谱柱的贮存条件：表6色谱柱类型贮存溶剂反相 C18,C12,C8,C4,C2,C1,Phenyl,PFP65%乙腈/35%水正相Silica,CN,NH2,PAC,DiolAlumina异丙醇或己烷离子交换SAX,SCX,WAX,WCX甲醇*体积排阻Diol0.05%NaN3水溶液或10%甲醇HILICLunaHILIC80%乙腈/20%水*在放入贮存溶剂前用50mL色谱纯水冲洗色谱柱6色谱柱清洗程序以下条件适用于Phenomenex硅胶色谱柱，但手性色谱柱除外（请参阅第五和第六章）：•在开始任何类型的清洗程序之前，请确保色谱柱内的溶剂或流动相可与建议的清洗溶剂互溶。•流速应是正常流速的1/5–1/2。 估算色谱柱体积，请使用以下公式： V=r2L V = 色谱柱体积(mL) r = 色谱柱半径(cm) L = 色谱柱长度(cm)未键合的硅胶(Si)使用10倍色谱柱体积的下列溶剂依次进行冲洗：•己烷•二氯甲烷•异丙醇•二氯甲烷•流动相脱水程序：用30mL2.5%2,2-二甲氧基丙烷和含2.5%冰醋酸的己烷冲洗色谱柱键合正相(CN,NH2,DIOL,PAC)使用10倍色谱柱体积的下列溶剂依次进行冲洗：•氯仿•异丙醇•二氯甲烷•流动相例外：反相模式下的LunaAmino。HILIC使用10倍色谱柱体积的下列溶剂依次进行冲洗：•95%水/5%乙腈（用于去除缓冲液）•95%100mM乙酸铵，pH5.8/5%乙腈•95%水/5%乙腈•流动相反相 (C18,C12,C8,C5,C4,C2,C1,PHENYL,PFP,CN,NH2)使用10倍色谱柱体积的下列溶剂依次进行冲洗：•95%水/5%乙腈（用于去除缓冲液）•THF（四氢呋喃）•95%乙腈/5%