2014春季巡讲-miRNA和lncRNA

李纪勤博士[e-mail]上海欧易生物医学科技有限公司2014年3月27日医药领域miRNA/lncRNA研究策略深度解析从实验到分析——主要内容•miRNA研究进展–Biomarker研究–功能机理研究•lncRNA研究策略–lncRNA--染色质重塑–lncRNA--转录调控–lncRNA--明星分子/通路–ceRNA2miRNA研究进展3成熟、多样的miRNA研究技术！SequencingAgilentAffymetrixQiagenMicroarray加尾法染料茎环法探针茎环法qPCRmiRNALuciferasereportvectormiRNAmimics/inhibitor4miRNA研究现状5CirculatingmiRNAbiomarker研究TrainingCohortValidationCohort差异表达miRNA疾病VS正常入组样本选取miRNA筛选目标miRNA6MathematicalModel研究目的：寻找肝癌血浆miRNA标志物研究内容：Discoveryphase—肝癌差异miRNA筛选Trainingphase—分析具有明显临床相关性的差异miRNAValidationphase—数学建模及验证上海中山医院JClinOncol.2011Dec20;29(36):4781-8.(IF=18.038)7肝癌血浆标志物DiscoveryphaseAgilentHumanmiRNAMicroarrayqPCR8TrainingphaseValidationphaseJClinOncol.2011Dec20;29(36):4781-8小结1.样本选取：血浆、血清、尿液、其他体液具有随访资料2.Discovery阶段：小样本量（8例以上）芯片、测序均可3.Training/Validation阶段：大样本量（100例以上）qPCR4.适用于肿瘤、药物敏感性、药物处理前后5.其他biomarker研究：lncRNA9子宫内膜异位症血浆标志物HumReprod.2013Feb;28(2):322-30.(IF=4.67)北京协和医院DiscoveryTraining3例异位症患者3例正常人40例异位症患者40例正常人AgilentHumanmiRNAMicroarray10小结优势：周期短：从接收样本到文章发表7个月经费可以承受后续：扩大样本量验证开展机理研究11调控机理研究感兴趣的表型？重要基因？寻找相关miRNA差异miRNA临床意义功能研究定量PCRmiRNA芯片PCRarray二代测序LossoffunctionGainoffunctionmiRNA-靶基因机制研究12miR-34调控机理年老小鼠vs年幼小鼠端粒长度减少、细胞凋亡增加靶基因PnutsmiR-34/pnuts互作调控心脏收缩功能Nature.2013Mar7;495(7439):107-10.miR-34↑13年幼小鼠心脏(6-8周)年老小鼠心脏(18–20月)miRNA芯片筛选差异靶基因预测结合表达谱芯片确定PnutsmiR-34a/pnuts功能验证C57BL/6micemiR-34a↑14荧光素酶报告系统功能缺失小结1.差异miRNA挑选：去掉已有研究的miRNA选取miRNA表达与表型明显相关的2.靶基因选取：多种靶基因预测软件联合使用(miRanda\PicTar\Targetscan)结合mRNA表达谱芯片数据3.miRNA芯片与mRNA芯片同步开展，节省研究时间，提升研究档次15miR-1调控机制(哮喘)JExpMed.2013Sep23;210(10):1993-2010.(IF=13.214)VEGF↑下游靶基因MplVEGF–miR-1–Mpl–P-selectineffectorpathwaymiR-1↓16CC10-rtTA-VEGFtg/WT小鼠miRNA芯片筛选差异VEGF–miR-1–MplmiR-1↓下游靶基因Mpl17JExpMed.2013Sep23;210(10):1993-2010.MolCancer.2013Dec9;12:155.(IF=5.134)miR-204调控机制（EC）TrkB基因HEC-1BshTrkB/HEC-1BIshikawaTrkB/Ishikawa芯片筛选差异miRNAmiR-204-5pTrkB靶miRNA分析miR-204-5p/TrkB功能研究互作验证细胞实验动物实验miR-204-5p与预后1819lncRNA研究进展non-proteincodingtranscriptslongerthan200nucleotideslncRNA20lncRNA研究现状源自Pubmed截至2014.03.0521NatRevGenet.2009Mar;10(3):155-9.NucleicAcidsRes.2012Aug;40(14):6391-400.lncRNA功能22转录调控明星分子/通路ceRNA转录调控明星分子/通路ceRNA实验思路差异lncRNA筛选样品的准备、处理和收集目标lncRNA染色质重塑功能验证临床意义分析机制探讨23案例1：染色质重塑BreastCancer研究主题：调控乳腺癌转移的lncRNA-HOTAIR研究思路：1.用Array筛选出HOTAIR2.临床研究——确定HOTAIR的临床意义3.体外研究——确定HOTAIR的肿瘤学功能4.机制研究——确定HOTAIR对染色质结构调节24Nature.2010Apr15;464(7291):1071-6.芯片筛选确定HOTAIR为研究目标入组样品选择6例正常乳腺组织，8例原位肿瘤，6例肝转移性肿瘤25Nature.2010Apr15;464(7291):1071-6.功能研究临床研究HOTAIR调节染色体结构GainoffunctionLossoffunction•小室实验•体内转移ChIP-chipPolycombrepressivecomplex2验证HOTAIR-PRC2机制26Nature.2010Apr15;464(7291):1071-6.•将染色质的调节/表观遗传学作为lncRNA下游机制探讨首选方法：ChIP（ChIP-PCR，ChIP-chip，ChIP-seq，MeDIP等）•做为lncRNA间接机制研究，下游通路采用“LossofFunction”即可小结27适用疾病类型：•breastcancer•lungcancer•ovariancancer•coloncancer•lungcancer•kidneycancer•braintumor•AcuteMyeloidLeukemia•HeadandNecksquamouscellcarcinoma•stomachcancer•Thyroidcarcinoma•…lncRNA深度数据挖掘—临床预后分析28明星分子/通路ceRNA29转录调控染色质重塑差异lncRNA筛选样品的准备、处理和收集目标lncRNA功能验证临床意义分析机制探讨实验思路PNAS.2014Jan21;111(3):1002-7.(IF=9.737)药物处理差异筛选与验证功能研究转录调控机制30案例2：lncRNA与转录调控PNAS.2014Jan21;111(3):1002-7.基因芯片筛选差异表达差异定量验证敲降lncRNA1992下调TNFα的表达TNFα负反馈调节lncRNA1992的表达31Pulldown分析WB验证急性川崎病32PNAS.2014Jan21;111(3):1002-7.小结转录因子的确定Pulldown实验—质谱分析—WB验证转录调控网络分析—预测转录因子—RIP分析33lncRNA深度数据挖掘—转录调控LncRNAs转录因子FDR（假阳性率）靶基因靶基因名称lincRNA:chr9:65651848-65652920reversestrandCTCF1.63E-71Tap1transporter1,ATP-bindingcassette,sub-familyB(MDR/TAP)lincRNA:chr9:65651848-65652920reversestrandCTCF1.63E-71Socs2suppressorofcytokinesignaling2lincRNA:chr9:65651848-65652920reversestrandCTCF1.63E-71Gp1bbglycoproteinIb,betapolypeptidelincRNA:chr9:65651848-65652920reversestrandCTCF1.63E-71DcxrdicarbonylL-xylulosereductaselincRNA:chr9:65651848-65652920reversestrandCTCF1.63E-71Sdcbp2syndecanbindingprotein(syntenin)2lincRNA:chr9:65651848-65652920reversestrandCTCF1.63E-71Rnase4ribonuclease,RNaseAfamily4lincRNA:chr9:65651848-65652920reversestrandCTCF1.63E-71Inhbainhibinbeta-AlncRNA-转录因子-靶基因3435明星分子/通路ceRNA转录调控染色质重塑差异lncRNA筛选样品的准备、处理和收集目标lncRNA功能验证临床意义分析机制探讨实验思路Cell.2010Aug6;142(3):409-19.研究背景：P53，重要的抑癌基因DNA修复过程中，p53稳定性增强，触发转录应答导致细胞凋亡36案例3：明星分子P53与lncRNA-p21芯片筛选入组样品选择差异lncRNA37Cell.2010Aug6;142(3):409-19.lincRNA-p21与P53互作目标lncRNAlincRNA-p21含有p53结合域•Pulldown•RIP•芯片•ChIP-chip•ChIP-qPCR38Cell.2010Aug6;142(3):409-19.大样本多套实验系统Time-course提升lncRNA研究精度小结39lncRNA数据深度挖掘—功能预测FoldchangeLncRNAprobeLncRNADescriptionGOtermPvalue2.89A_30_P01026515lincRNA:chr6:47595238-47601893forwardstrandproteinbinding02.89A_30_P01026515lincRNA:chr6:47595238-47601893forwardstrandintegraltomembrane02.89A_30_P01026515lincRNA:chr6:47595238-47601893forwardstrandplasmamembrane02.89A_30_P01026515lincRNA:chr6:47595238-47601893forwardstrandintracellular02.89A_30_P01026515lincRNA:chr6:47595238-47601893forwardstrandmembrane02.89A_30_P01026515lincRNA:chr6:47595238-47601893forwardstrandATPbinding02.89A_30_P01026515lincRNA:chr6:47595238-47601893forwardstrandregulationoftranscription,DNA-dependent04041明星分子/通路ceRNA转录调控染色质重塑差异lncRNA筛选样品的准备、处理和收集目标lncRNA功能验证临床意义分析机制探讨实验思路DevCell.2013Apr15;25