荧光定量PCR技术原理、方法、数据分析详述

不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路15号）Fax：[phone]Tel：[e-mail]不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案---核酸提取攻略北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路15号）不同样品RNA提取最适方法RNA纯度与质量考察RNA提取常见问题及解决方案常见样品DNA提取特殊样品DNA提取DNA分离纯化中常见问题分析内容概要样品裂解液上层溶液液氮研磨或其他方法处理抽提细胞裂解干燥溶解或洗脱离心洗涤酒精沉淀或介质吸附RNA提取流程沉淀法：异丙醇或乙醇介质吸附法：RNA提取常用方法---沉淀方法吸附材料原理硅基质高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附并携带RNA异硫氰酸胍/苯酚法在变性剂异硫氰酸胍的作用下，细胞被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。RNA提取常用方法---裂解方式胍盐/β-巯基乙醇盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性；β-巯基乙醇变性蛋白BioTeke的RNA提取试剂具有明显的优势在经典试剂的基础上，不断升级。多款高品质的RNA提取试剂：Tripure（Trizol）RNApure（Trizol法的升级产品）组织/细胞样品RNA提取材料：小鼠肝脏组织方法：BioTekeRNApure高纯总RNA快速提取试剂盒0.1g样品组织结果：图：小鼠肝脏组织RNA1234RNApure高纯总RNA快速提取试剂123图片说明：1BioTekeRNAclean2BioTekeTRIpure(TRIzol法)3BioTekeRNApure离心柱型(注：本图实验材料为植物叶片）同一样品基因组DNA和RNA分提原理：根据基因组DNA和RNA在硅基质膜上的结合条件不同，用两根离心吸附柱分别提取基因组DNA和RNA。特殊样品RNA提取---血液图1全血样品溶解在TRIpureLSReagent试剂后的状态图2泳道1与2，在-80度保存一个月后的提取结果。M泳道：标准的Hela细胞RNA材料：松针、冬青、香蕉、木菠萝和杨树方法：通用植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）0.1g样品组织结果：得率：约35-40μg纯度：OD260/OD280＝1.82-1.95图片说明：1、2杨树；3、4香蕉；5、6松针；7、8冬青；9、10木菠萝多糖多酚植物样品RNA的提取12345678910试剂盒适用范围：水稻种子、小麦种子、玉米种子、高粱种子、拟南芥种子、大豆种子、苹果、葡萄、香蕉、棉花、龙眼、荔枝、各种草坪牧草植物、各种树木、各种花卉等绝大多数植物图片说明：1、2DNA和大RNA；3、4MicroRNA(材料为小鼠肝脏组织)MicroRNA提取1234提取原理：传统方法：先提取总RNA然后跑胶回收或沉淀MicroRNA。新方法：通过裂解液裂解和酸酚分层后过柱两次，一次去除基因组DNA和大片段RNA，后一次吸附MicroRNA，然后漂洗收集。新方法特点：高效分离小RNA，同时分离总RNA可用于miRNA、siRNA和snRNA的分析适用各种来源的样品提取时间短，约30分钟完成实验生物大分子具有共轭双键，在260和280nm波长处有光吸收峰。纯度：紫外分光光度计测定所提总RNA在260nm和280nm波长处的光吸收，以A260/A280的比值来判断总RNA的纯度。质量：甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。RNA纯度与质量考察RNA提取常见问题及解决方案RNA的降解OD260/OD280比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳RNA的降解新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。RNA的降解冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，研磨过程中及时补充液氮。RNA的保护采集样品的保护：通常用液氮保存样品保护剂RNAfixer,样品浸泡其中可以在37℃保存一天，25℃一周，4℃一个月，-20℃一年左右。环境中RNase的清除：DEPC处理各种实验器具RNAsafe对溶液中RNase进行清除。RNA酶喷雾清除剂，可对固体表面的RNase起到清除的作用，更大程度上避免RNase的污染。蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260/OD280比值偏低OD260/OD280比值偏低抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.10-0.50之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD时，对照及样品稀释液请使用10mMTris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。非变性电泳：上样量超过3μg，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致28S和18S条带分不开。变性电泳条带变淡：EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。电泳条带异常抽提试剂的残留75%乙醇洗涤样品中杂质的残留多糖等杂质，再次沉淀DNA污染使用RNase-Free的DNaseI消化抽提RNA下游实验效果不佳（RNA降解）不同样品基因组DNA提取常见样品基因组DNA提取细胞/组织/细菌/血液基因DNA提取植物材料DNA提取特殊样品基因组DNA提取大量血液样品DNA提取环境微生物DNA提取临床样本DNA提取DNA分离纯化中的常见问题分析基因组DNA提取流程化学方法CTAB法：适用于植物材料等。是一种阳离子去污剂，溶解细胞膜，与核酸结合。在高盐下溶解释放DNA。SDS法：适用于血液，细胞，动物组织，细菌，酵母等物理方法机械剪切，超声波破碎，研磨匀浆等。易造成DNA断裂。酶法蛋白酶KBioTeke基因组DNA提取系列试剂盒综合利用上述方法基因组DNA提取流程-细胞裂解特点：不需要使用有毒的氯仿、苯酚等试剂多次柱漂洗确保高纯度；长度可达30-50Kb提取原理：组织/细胞/细菌/血液基因组DNA提取玉米叶片基因组DNA提取（使用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒）提取原理：植物材料基因组DNA提取特殊样品基因组DNA提取传统方法适用于所有材料基因组DNA的提取？比如大量血液？比如土壤/粪便中的微生物基因组DNA的提取？比如病毒及其他微量样品DNA的提取？NO！中量/大量血液基因组DNA提取传统方法消化后，用酚/氯仿抽提，时间长，损害操作人员健康BioTeke创新不用蛋白酶消化不用酚/氯仿抽提结果：得率：约75-250μg/5mL血样纯度：OD260/OD280＝1.87-1.955ml全血基因组DNA提取电泳结果土壤/粪便微生物基因组DNA提取其他品牌试剂盒存在缺点：采用玻璃珠或钢珠破碎，导致基因组断裂严重；必须购买破碎专用设备，增加使用成本；采用包括玻璃奶、离心吸附柱串联的纯化方式，导致DNA大量损失，得率很低，很难真实反映土壤微生物的多样性。BioTeke的技术创新：采用酶法破碎，保证基因组的完整性；用异丙醇沉淀DNA，DNA无损失。厂家破碎方式纯化方式提取时间是否需要专门设备BioTeke酶法破碎基因组完整离心柱吸附杂质纯度高1小时内不需要Q公司钢珠破碎基因组断裂玻璃奶同离心柱结合得率低2小时需要M公司玻璃珠破碎基因组断裂离心柱纯化得率较低2小时需要临床样品基因组DNA提取病毒基因组DNA提取酵母基因组DNA提取口腔拭子DNA提取微量样品DNA提取石蜡组织DNA提取头发DNA提取一步法DNA提取扩增原理：综合微量样品基因组DNA提取和高效的PCR扩增试剂。从毛发、石蜡组织等微量组织中高效提取足够浓度的DNA，然后进行PCR扩增。操作简单、方便，可对大量样品同时进行操作。保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存基因组DNA分离纯化中的注意事项保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存基因组DNA分离纯化中的注意事项•简化操作步骤，缩短操作时间•减少物理因素对DNA的降解，震荡、搅拌等•减少化学物质对DNA的降解，操作多在pH4-10•防止基因组DNA的生物降解：DNase保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存基因组DNA分离纯化中的注意事项•洗脱液65度预热10分钟•洗脱体积不小于30μL•洗脱2次或者3次保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存基因组DNA分离纯化中的注意事项•可长期储存于pH=7.0的ddH2O或TE•不易制成干品储存•分装低温保存如何提高微量核酸提取或回收后的浓度核酸助沉剂的应用微量吸附柱的应用---15μl洗脱体系质粒提取胶回收或PCR产物回收微量细胞/组织DNA/RNA提取病毒DNA/RNA提取微量临床样本DNA/RNA提取不同样品核酸提取、扩增、荧光定量PCR完美解决方案---Real-timeqPCR攻略北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路15号）RT-PCR原理Real-timeqPCR原理及应用Real-timeqPCR成功关键Real-timeqPCR数据分析Real-timeqPCR常见问题及解决方案主要内容中心法则与RT、PCRRNADNARTPCR逆转录反应可以以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。提取RNA的质量会影响到RT的产量及cDNA的完整性。整个过程要求无RNA酶操作。反转录酶、RNA酶抑制剂都会对产物的质量造成一定的影响。反转录相关因素SuperM-MLV反转录酶高效的逆转录活性，且无RNaseH活性ThermoM-MLV反转录酶高效的逆转录活性，且无RNaseH活性适合合成长片段的cDNA,有很强的模板兼容性，对高GC含量（75%以上）和结构复杂的模板效果显著在42℃-60℃具有较好的热稳定性。OnestepRT-PCR模板：使用BioTeke公司的RNApure总RNA提取试剂盒提取的鸡肝脏组织RNA目的片段：管家基因β-Actin反应体系：反应程序：RT-PCR相关产品SuperM-MLV反转录酶，10000u/198元SuperRTKitcDNA第一链合成试剂盒50次，特价490元SuperOne-stepRT-PCRKit一步法RT-PCR试剂盒50次，特价880元Thermo系列产品买二赠一！ThermoM-MLV反转录酶，10000u/580元ThermoRTKitcDNA第一链合成试剂盒50次，价格1200元ThermoOne-stepRT-PCRKit一步法RT-PCR试剂盒50次，价格1400元反转录酶及试剂盒系列产品讲座期间特价优惠！RT-PCR原理Real-timeqPCR原理及应用Real-timeqPCR成功关键Real-timeqPCR数据分析Real-timeqPCR常见问题及解决方案实时荧