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ZLSOP表面微生物测试操作规程第1页共5页仲景宛西制药股份有限公司-操作规程表面微生物测试操作规程ZLSOP表面微生物测试操作规程执行日期起草审核批准部门质控部质控部质保部质量技术副总姓名张淑萍周里欣李海军章运典签名日期分发部门质量控制部1目的：建立洁净室（区）表面微生物测试操作规程，确定洁净区中物体（包括工作服）表面微生物污染的程度以及洁净区的消毒效果。2适用范围：适用于公司洁净室（区）、无菌室和净化工作台的表面，洁净室（区）设备表面，进入洁净室区人员表面。日常动态检测和空气净化系统确认时的检测。3责任者：质量控制部、质量保证部、化验员、负责洁净区洁净度动态测试的质监员。内容1测试方法：接触平皿法、棉签擦拭法、表面冲洗法。测试方法必须考虑取样的准确性和代表性，可以从定性和定量来选择。1.1接触平皿法：只适用于规则物体的表面。1.2棉签擦拭法：适用于平皿接触法不适用的设备和不规则表面的取样。棉质和涤纶棉签可以浸入到肉汤培养基内得到定性结果。1.3表面冲洗法：当需要确定设备表面的生物载荷时，或面积较大时。用无菌水来冲洗内表面，然后收集、膜过滤后得到定量结果。2仪器、用具与培养基：2.1仪器：电热恒温干燥箱、压力蒸汽灭菌器、药物天平、冰箱。ZLSOP表面微生物测试操作规程第2页共5页仲景宛西制药股份有限公司-操作规程2.2用具：培养皿（ф55mm×18mm的培养皿）2.3培养基：大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）。3操作前准备及要求3.1培养基平皿的制备3.1.1培养皿的清洗与灭菌：取培养皿，用饮用水清洗，凉干后浸入清洁液中，浸泡12小时以上，用饮用水冲洗干净，再用纯化水冲洗三遍，置铁筒等密闭容器内，121℃湿热灭菌20分钟，备用。3.1.2培养基的制备：称取大豆酪蛋白琼脂40g，置2000ml烧杯中，加水1000ml，置电热炉上，加热煮沸使溶解，滤过，分装于500ml三角瓶中，用棉塞把瓶口塞好，包扎牛皮纸，在121℃湿热灭菌15分钟，备用。3.1.3培养基平皿的制备：将培养基加热熔化，冷却至约45℃时，在无菌操作下取培养基约10ml，注入无菌培养皿中，加盖后室温放至凝固，制备后培养基平皿在2℃～8℃存放。使用前应仔细检查每个培养皿的质量，培养皿及培养基有变质、破损或污染的不能使用，存放时间不得超过一周。3.3.2表面微生物检测人员穿戴与生产区空气洁净度级别相适应的工作服，按照《微生物检查实验室管理规程》进入洁净室（区），外面的衣服不能带进洁净区，盛装培养皿的容器从物流通道或传递窗进入洁净区。4测试状态：4.1洁净室(区)已处于正常生产状态，设备在指定的方式下运行，并且有指定的人员按照规范操作。4.2洁净室（区）的温度和相对湿度：温度应控制在18～26℃，相对湿度控制在45%～65%之间。4.3压差：洁净区与非洁净区之间，不同级别洁净区之间的压差应当不低于10帕斯卡，产尘量大的操作间对相邻房间应保持相对负压。5取样5.1取样点数目及其布局应根据以下几个方面设置：空调系统初始确认的结果；房间（或区域）的大小和布局；房间（或区域）的用途；与暴露产品的距离，人流物ZLSOP表面微生物测试操作规程第3页共5页仲景宛西制药股份有限公司-操作规程流方向等。对于同一洁净区或区域，每个相同取样物体应采1个样。5.2取样方法及步骤5.2.1培养基平皿进入洁净室培养基平皿随检测人员进入一更后缓冲间，检测人员换洁净工作鞋、洗手消毒后，用蘸有75%乙醇溶液的丝光毛巾擦拭盛放培养基平皿的铁桶外表面，进入二更室，检测人员按照相应更衣程序更衣后，进入二更后缓冲间，手消毒后，再用蘸有75%乙醇溶液的丝光毛巾擦拭盛放培养基平皿的铁桶外表面，烘干，即可进入C、D级洁净区使用；培养基平皿在进入A级洁净区前应先将盛放培养基平皿的铁桶置紫外灯下灭菌20min。5.2.2取样方法5.2.2.1A级洁净区检测人员戴上无菌手套，将密闭铁桶放置于A级环境下，打开铁桶盖，取出所需数量的培养基平皿后盖上铁桶盖，取出的培养基平皿其中1只平皿不打开平皿盖，正放在A级环境下作为空白对照。为检测培养皿运输或搬动过程中培养基是否受到污染，另取3只培养基平皿作为空白对照。其余平皿进行下列取样操作：5.2.2.1.1设备环境取：样在关键生产操作完成后，打开培养基平皿，将培养皿扣在灌装机表面，使培养基与灌装机表面接触，10s后盖盖，在取样培养皿外编号标识，将培养皿放回密闭铁桶内。采样结束后立即用注射用水及消毒剂对取样部位清洗消毒。5.2.2.1.2人员取样：在关键生产操作完成后，对在A级环境下的操作人员进行五指手套取样。打开培养皿，使操作人员五指轻轻按在培养基表面，10s后盖盖，在取样培养皿外编号标识，将培养皿放回密闭铁桶内。取样结束后在空白对照培养皿外编号标识，将空白对照培养皿放入铁桶内。5.2.2.2C、D级洁净区检测人员将盛放培养皿的密闭铁桶放在C、D级洁净区工作台上，打开密闭铁桶，取出所需数量的培养基平皿后盖上铁桶盖，取出的培养基平ZLSOP表面微生物测试操作规程第4页共5页仲景宛西制药股份有限公司-操作规程皿中1只平皿不打开平皿盖，正放在C、D级环境下做为空白对照，以检测培养皿运输或搬动过程中培养基是否受到污染，其余平皿进行下列取样操作：5.2.2.2.1设备环境取样：打开培养基平皿，将培养皿扣在墙壁、地面、天花板、设备表面等任意部位取样，使培养基与取样部位接触，10s后盖盖，在取样培养皿外编号标识，将培养皿放回密闭铁桶内。采样结束后立即用纯化水及消毒剂对取样部位清洗消毒。5.2.2.2.2人员取样:打开培养皿，对操作人员口罩、洁净工作帽前额处、两只眼镜镜片，工作鞋与工作裤连接处、前胸处、手肘处取样，将培养基轻压在取样部位，10s后盖盖，在取样培养皿外编号标识，将培养皿放回密闭铁桶内。5.2.2.3取样结束后在空白对照培养皿外编号标识，将空白对照培养皿放入铁桶内。5.3培养将取样培养皿及空白对照培养皿倒置于30～35℃恒温培养箱中培养，同时另取3只同批次配制的培养基倒置于30～35℃恒温培养箱中培养做另一空白对照试验，以检测培养基保存过程中是否受到污染。培养48h。5.4菌落计数：5.4.1对培养皿上所有的菌落直接用肉眼计数、标记或在菌落计数器上点计,然后用5～10倍放大镜检查,是否有遗漏。5.4.2若出现在平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。5.4.3用做空白对照的培养基平皿均应无菌落生长。6注意事项：6.1测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。6.2采取一切措施防止采样过程中的污染和其他可能对样本的污染。6.3对培养基、培养条件及其他参数做详细的记录。6.4由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养基背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并必须注意细菌菌落与培养物沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。ZLSOP表面微生物测试操作规程第5页共5页仲景宛西制药股份有限公司-操作规程6.5采样前仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。6.6培养皿在用于检测时，为避免培养皿运输或搬动过程造成的影响，宜同时进行对照试验，每个区域取1个对照皿，与采样皿同法操作但不需暴露采样，然后与采样后的培养皿（TSA）一起放入培养箱内培养，结果应无菌落生长。7洁净室区微生物检测限度7.1表面微生物动态监测限度洁净度级别接触（Ф55mm）cfu/碟5指手套cfu/手套A级11B级55C级25---D级50---8结果评定8.1每个采样点表面微生物菌落数必须低于所选定评定标准中的界限。8.2测试时若某测点的表面微生物菌落数超过评定标准，则重新采样两次，两次测试结果均合格。才能判为合格，否则查明原因及时采取纠正预防措施。8.3测试时若取样过程中留出的空白对照培养基长菌则重新取样，若质量控制部留样用空白对照培养基长菌或两者均长菌则另取一批培养基重新取样检测。9记录：测试报告中应记录洁净室（区）的检测日期、洁净室名称、洁净级别、检测状态、培养基名称、培养基批号、培养箱编号、检测依据、检测人、结论。变更历史版本号执行日期修订摘要00--------01--------02--------03--------042015.12.1----05页眉增加文件编号及名称，共X页；正文增加变更历史；