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实时定量PCR技术目录•实时定量PCR基本原理•实时定量PCR的实验设计和数据处理•实时定量PCR两种相对定量方法比较•实时定量PCR实验实例分析•实时定量PCR常见故障排查•实时定量PCR的新应用实时定量PCR基本原理常规vs实时•常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析•定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析常规vs实时•优缺点比较定量PCR常规PCR灵敏度高高精确度安全省时只能进行半定量或定性分析不安全易污染费时费力定量PCR三个基本概念•扩增曲线指数增长期平台期线性增长期背景期阈值与C(t)值•阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期•C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04定量PCR的数学原理•理想的PCR反应：Xn=X0×2n•非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得:logXn=log(X0(1+Ex)n)整理方程式得:logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn•将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+logXc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210C(t)与初始模板含量•初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系定量原理•浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量化学原理•化学方法分类−非特异性SYBRGreenI法−特异性TaqMan探针法SYBRGreenI法•结合双链DNA分子小沟−延伸结束，形成双链DNA，SYBRGreen结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度•优点−使用方便，无需复杂的设计−成本较低•缺点−与非特异性产物结合，无模板特异性−试验方法较难优化−灵敏度低TaqMan探针法•水解型−报告基团，淬灭基团−FRET（荧光谐振能量传递）−识别特异性产物•优点−特异性高，可准确定量−灵敏度高−设计不同标记的探针，可进行多重检测•缺点−一个探针只适用于一个目标−价格较高−探针设计较繁琐两种化学的比较化学试剂工作原理有否淬灭剂信号检测阶段SYBRGreenI结合于双链DNA的小沟中否延伸TaqMan水解型杂交探针（5‘-3’外切）有任何步骤定量PCR的实验设计和数据处理绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量•绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）•相对定量：计算初始反应模板的相对含量定量PCR--绝对定量•标准品，标准曲线−已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释−根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线•样品−与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值unknown104103使用定量PCR进行绝对定量的优势•敏感性高−检测低拷贝数样品：单拷贝•大范围拷贝数样品同时检测−100—1010•省时有效定量PCR--相对定量•相对定量的目的−比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）•相对定量的问题−样品材料不均一造成的差别•内标基因−内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）−对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差SYBRGreenI法进行相对定量的问题问题：SYBRGreenI可以与非特异性双链结合非特异产物信号结果不准确解决办法：引入熔链曲线分析熔链曲线分析•在PCR反应程序结束后，逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线温度荧光信号强度TmTm值：DNA解链一半时的温度-dIdTTm熔链曲线分析•决定退火温度Non-specificproductspecificproductspecificproduct实时定量PCR两种相对定量方法比较相对双标准曲线法和2-ΔΔc(t)法相对标准曲线法•用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线•处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值•用内标基因对目标基因均一化•处理样本与未处理样本目标基因C(t)值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异适用范围•目标基因与内标基因扩增效率差异较大•扩增效率较低2-ΔΔc(t)法•公式推导−M:目标基因，N：内标基因−XC(t)M=X0M*2C(t)M=A(域值)(1)−XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值)(2)−均一化(1)/(2):−X0M/X0N=2C(t)N-C(t)M=2-ΔC(t)−处理2与处理1相比：−(X0M2/X0N2):(X0M/X0N)=2-ΔC(t)2-ΔC(t)1=2-ΔΔC(t)−ΔΔC(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1)•当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点相比一般步骤•选定目标基因和内标基因•设计一步法或两步法RT-PCR反应•数据获得及处理−目标基因C(t)值（处理，未处理）−内标基因C(t)值（处理，未处理）−计算2-ΔΔc(t)−作图适用范围•当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较一致★•不做标准曲线，高通量检测目标基因和内标基因扩增效率的快速检测•通过并列跑两条扩增曲线，查看指数增长期的曲线之间是否平行验证试验目的基因和内参基因扩增效率一致性检测检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的ΔC(t)，以稀释倍数与ΔC(t)作图，当直线的斜率近似于0（绝对值要小于0.1）时，说明目标基因与内标基因扩增效率一致。问题与解决为保证扩增效率一致–扩增子长度–引物设计–模板纯度、复杂度等–反应条件定量PCR实验实例分析利用TaqMan法研究ERBB2在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异（相对标准曲线法）•已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准•选用GAPDH作为内标基因−FAM标记的ERBB2探针−VIC标记的GAPDH探针•构建标准曲线•双重PCR反应•阴性对照−无RNA对照（空白）−无逆转录酶对照（基因组）标准曲线Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2样品扩增：正常vs肿瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH肿瘤肿瘤正常正常实验结果MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43±0.0426.24±0.17ERBB2表达MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma23.2722.8123.4122.8628.34±0.1026.83±0.03GAPDH表达实验结果HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/µlTotalRNAERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.0110.0180.018/0.011＝1.6300.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpression（2-ΔΔc(t)法）•ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.18•2-ΔΔc(t)=1.51-1.93•结果与双标准曲线法相近HealthyRNABBER2GAPDHΔC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43±0.0428.34±0.105.18±0.18CarcinomaRNABBER2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24±0.1726.83±0.034.41±0.21实时定量PCR常见故障排查故障排查---软件界面•扩增曲线•标准曲线•原始数据扩增曲线异常扩增曲线扩增曲线•基线设置是否正确基线校准基线开始值(3-10)基线终止值（指数期之前）•阈值设置是否正确设置在指数增长期(可自动或手动设置）标准曲线原始数据常见问题•抑制物PCR前•精密度差•扩增曲线异常PCR后•标准曲线差抑制物•PCR抑制物多糖类、有机溶剂、蛋白酶K等•样本质量A260/A280----DNA:≥1.8----RNA:≥2.1•RT反应中的抑制物----RNA标准曲线PCR抑制物抑制物？样本质量起始模板量越高，抑制物含量越高RNA标准曲线精密度差精密度高精密度低40次相同的重复3次相同的重复精密度低的原因•加样误差操作、移液器、反应液未混匀•体系配置方法•低拷贝数的样品（泊松分布）•没有使用ROX校准扩增曲线异常—平台期低样品浓度？引物二聚体或浓度？扩增曲线异常—指数增长期异常无指数增长期或指数增长期较短扩增曲线异常—曲线不光滑扩增时间开始较晚，定量不准确标准曲线评价评价标准曲线：扩增效率(E)---90%-110%相关系数(R2)---大于0.99平行管重复性---SD小于0.167标准曲线差可能的影响因素稀释精度加样精度反应体系的优化模板降解定量PCR的新运用•等位基因分型（SNP研究)•MicroRNA分析•基因拷贝数（CNV)分析•蛋白质分析