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异硫氰酸胍强用力的蛋白质变性剂,能迅速溶解蛋白质,导致细胞结构破碎,核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂,在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍,它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。含有强力的阴离子和阳离子基团,它们可以形成较强的氢键。在还原剂存在的情况下,异硫氰酸胍可以断裂氢键,而去垢剂,如SDS存在的情况下,可以破坏疏水作用。盐酸胍、尿素盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂,它并不是一种足够强的变性剂,可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来。4-8M可断裂氢键,有两种可能机制:1变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合,形成变性蛋白-变性剂复合物,当复合物被除去,从而引起N-D反应平衡向右移动,随着变性剂浓度增加,天然状态的蛋白不断转变为复合物,最终导致蛋白质完全变性;2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用,能形成氢键,当浓度高时,能破坏水的氢键结构,结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂,使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强,盐酸胍、尿素引起的变性往往是不可逆的。高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性十二烷基肌氨酸钠使蛋白质解体变性巯基试剂1防止蛋白质或酶等(如辅酶A)分子中SH基团氧化成二硫键,2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。DTT,DDTE、巯基乙醇应用最广,谷胱甘肽也常应用,由于他是生物体内的还原剂,同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。DNA提取中,常使用巯基乙醇,维持缓冲液的还原环境,防止多酚类氧化,由于具有一定的毒性,浓度不应高于2%。巯基乙醇β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键(肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键)。1还原蛋白质二硫键,使Rna酶变性2抑制酚类氧化,若氧化,核酸会变成灰黑色,苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联3保护蛋白质的巯基蛋白质提取中需要巯基乙醇还原二硫键,使RNA酶失活化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白质变性但不影响肽键和二硫键,不能使蛋白质彻底变性加上还原剂巯基乙醇或DTT,能还原二硫键,使RNA彻底变性DTT二硫苏糖醇刺激性气味要小很多,毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时,两者效果相近,但DTT价格略高一些。由于容易被空气氧化,因此DTT的稳定性较差;但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低,随着pH值的降低,DTT的有效还原性也随之降低;DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。抑制Rnase活性TCEP三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐半胱氨酸Trizol苯酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase(RNA酶)。0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。液氮组织破碎,裂解细胞SDS十二烷基硫酸钠阴离子去垢剂,高温(55-65℃)裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,形成SDS/蛋白质/多糖复合物,释放核酸,提高盐(KAc或NaAc)浓度并降低温度(冰浴),使SDS/蛋白质/复合物转变为溶解度更小的钾盐酸形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀水相中的DNA操作简单,温和,可提取到高分子量的DNA,但产物多糖类杂质较多阳离子强表面活性剂,通常与蛋白酶K和抗氧化剂、螯合剂一起使用可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离溶解膜类蛋白SDS能裂解细胞。使细胞中的蛋白质和核酸之间常借着静电引力或配位键结合,阴离子去污剂能够破坏这种价键,使染色体离析,蛋白变性,释放核酸。(1)SDS是一种阴离子表面活性剂,能使蛋白质的氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质的疏水部位;(2)SDS可引起蛋白质构象改变(3)SDS是一种良好的解离剂,可使蛋白质溶解,变性(4)形成SDS-蛋白质复合物,并使复合物带负电质粒方面:在1%的SDS溶液中慢慢加入5N的NaCl,你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl,你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassiumdodecylsulfate,PDS),而PDS是水不溶的,因此发生了沉淀。如此看来,溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐,使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。基因组DNA一旦发生断裂,只要是50-100kb大小的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了CTABCTAB:十六烷基三甲基溴乙胺,低温时易沉淀阳离子去污剂一种在高盐下能和核酸结合形成可溶、稳定的复合物,低盐浓度下可沉淀的表面活性剂是一种阳离子去污剂,低离子强度(0.1-0.5MNaCl),沉淀核酸与酸性多聚糖,而蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液中。在高离子强度的溶液中(0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB可从大量产生黏多糖的植物及某些革兰氏阴性菌制备纯化的DNA,这种去污剂加入调节至高离子强度的细菌和细胞裂解液中(>0.7MNaCl),经过连续的酚/氯仿抽提,去除CTAB/黏多糖/蛋白质复合体,异丙醇/无水乙醇沉淀上清即可将DNA分离出来CTAB还有提高DNA互补链复性速率及稳定已形成的DNA双螺旋的作用CTAB法的主要特点是用用较广CTAB溶液在低于15度会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料时,必须预热,且离心温度不低于15度EDTA酶抑制剂,螯合二价金属,抑制金属依赖性的酶螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制细胞中DNase的活性,该酶可降解DNAEDTA是去垢剂,结合离子用,而它结合的部分离子是能够诱发或者促进RNA酶活性的,比如Ca2+。EDTA是一种二价离子熬合剂,能熬合Mg2+和Ca2+等二价阳离子,而多种RNA酶的活性是需要依赖二价阳离子的,所以EDTA能通过熬合二价阳离子来抑制RNA酶的活性碱性条件下才能够溶解,要和NaOH粉末混合后,再加水,然后用NaOH水溶液调节pH。0.01M,DNase酶基本失活。BSA酶抑制剂,使一些降解酶的活性的表面变性精胺或其他多胺酶抑制剂,降低核酸酶的影响氰化物酶抑制剂,降低重金属氧化酶的影响PVP减少酚类、醌类、单宁类物质的影响,抗氧化作用,络合多酚和萜类物质,防止多酚类褐变而氧化,去除多糖和色素,色素是PCR强抑制剂,必须去除样品液氮研磨及提取缓冲液中加入PVP或PVPP等能络合多酚和萜类物质,离心或氯仿抽提出去,有效防止多酚氧化成醌类,避免溶液变褐色而具有抗氧化能力提取液中加入适量的PVP或PVPP能提高DNA的纯度,用量根据杂质而定(1-6%),PVP同时能去除多糖,因此将PVP和巯基乙醇配合使用并调整用量,能有效防止多酚污染PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。Triton-x100TritonX100之类的去垢剂有苯环结构,所以在280nm有很强的吸收。蛋白酶K蛋白酶K:切割活性较广的丝氨酸蛋白酶,切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽键,将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。蛋白酶K在较广的pH范围内均有活性(pH4-12.5)温度范围37-60度盐浓度3MGuHCl或4M尿素中均有活性在一些去污剂:Tween20(5%)、TritonX-100(1%)和SDS(1%)条件下也有活性。蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理,尤以DNA样品为佳.如组织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌物、尿,粪便等.蛋白酶K的一般工作浓度是50—100μg/ml蛋白酶(蛋白酶K或链酶蛋白酶)可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase和RNase),DNase和RNase也用于去除不需要的核酸,有人使用蛋白酶替代DEPC处理水的,但有些人说效果不好。蛋白酶K,威力巨大的广谱蛋白酶,95C加热10分钟,则完全失活。数年前首次使用它替代DEPC处理RNA抽提用的离心管和枪头,效果不错;后来又用于处理RNase-Free的水,效果也是一级棒。从此就再也不用DEPC了。配制RNA裂解试剂时,直接用灭菌的双蒸水配制,最后,加入蛋白酶K至终浓度1ug/ml。轻轻混匀,室温放置15分钟后即可。枪头及离心管去除RNase:先将枪头及离心管清洗干净后,移入预先混好的含1ug/ml蛋白酶K的双蒸水,彻底浸入。室温放置30分钟后,连水一起高压灭菌。弃水后,烘干即可。RNase-Free水的获得:直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶K至终浓度1ug/ml。轻轻混匀,室温放置15分钟后,灭菌处理即可。该蛋白质的残留对后续实验没有可见的影响。无蛋白质残留的RNase-Free水的获得:这比较麻烦。直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶K至终浓度1ug/ml。轻轻混匀后,倒入专用的蒸馏器中。放置15分钟后,加热蒸馏,流出的就是无蛋白质残留的RNase-Free水。要提醒的是,该专用蒸馏器头几次流出来的水,只能当普通蒸馏水用,因为通道中难确保RNase-Free的环境;另外,一定要主要密闭性,否则,流出的水又被污染了。DNA裂解液的作用是破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离,抑制细胞中Dnase的活性,而蛋白酶k的作用是将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来!溶菌酶溶壁酶DnaseRnase多糖水解酶:水解多糖饱和酚酚是一种有机溶剂,预先要用STE缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联:故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛,以防止酚氧化。苯酚非极性分子水为极性分子使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。使用酚的优点:1.有效变性蛋白质;2.抑制了DNase的降解作用。能有效使蛋白质变性而出去,酚形成的有机相破坏蛋白质的胶体稳定性,从而蛋白质不会分布在水相中,避免核酸污染缺点:1.能溶解10-15%的水,从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。酚变性大,但与水相有一定程度的互溶,大约10-15%的水溶在酚相中,使核酸损失酚(Phenol)对蛋白质的变性作用远大于氯仿,按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉,但是水饱和酚的比重略比水重,碰到高浓度的盐溶液(比如4M的异硫氰酸胍),离心后酚相会跑到上层,不利于含质粒的水相的回收;但加入氯仿后可以增加比重,使得酚/氯仿始终在下层,方便水相的回收;还有一点,酚与水有很大的互溶性,如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中,而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应),应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除,而用酚/氯仿的混合液进行抽提,跑到水相中的酚则少得多,微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而
本文标题:核酸提取常见试剂的作用原理
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