氨基酸分析仪原理

氨基酸分析仪基本原理及应用氨基酸分析仪基本原理及应用上海交通大学分析测试中心上海交通大学分析测试中心侯敬丽侯敬丽内容内容一、一、氨基酸氨基酸二、二、氨基酸分析仪氨基酸分析仪三三、、样品的制备样品的制备四、四、应用应用（一）氨基酸的定义（一）氨基酸的定义氨基酸：是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。氨基酸含有一个碱性氨基和一个酸性羧基，氨基一般连在α-碳上。一、氨基酸一、氨基酸（（aminoacidsaminoacids））‹组成蛋白质的20种氨基酸除甘氨酸外，都有一个不对称碳原子，即а-碳原子。‹а-碳原子有四个不同取代基：羧基、氨基、氢原子和R基团，不同氨基酸的R基团不同。‹每种氨基酸有D-构型和L-构型，天然蛋白质中的氨基酸都是L-构型。‹广泛存在于食品、药品、水产品、饲料和体液（血液、尿样等）。Ｒ｜Ｈ-Ｃ－ＣＯＯＨ｜ＮＨ２氨基酸在溶液中受溶液pH的影响存在着下列平衡：pHpIpH=pIpH＜pI偶极离子--净电荷为零--在电场中不移动，此时溶液的pH值称为等电点（pI）。OH-H+OH-H+RCHCOO-NH2+NH3_RCHCOOHRCHCOONH3+氨基酸等电点氨基酸等电点„„丙氨酸丙氨酸Ala(AAla(A)6.02)6.02精氨酸精氨酸Arg(RArg(R)10.76)10.76„„天冬酰胺天冬酰胺Asn(NAsn(N)5.41)5.41天冬氨酸天冬氨酸Asp(DAsp(D)2.98)2.98„„半胱氨酸半胱氨酸Cys(CCys(C)5.02)5.02谷氨酸谷氨酸Glu(EGlu(E)3.22)3.22„„谷氨酰胺谷氨酰胺Gln(OGln(O)5.65)5.65甘氨酸甘氨酸Gly(GGly(G)5.97)5.97„„组氨酸组氨酸His(HHis(H)7.58)7.58亮氨酸亮氨酸Leu(LLeu(L)5.98)5.98„„赖氨酸赖氨酸Lys(KLys(K)9.74)9.74蛋氨酸蛋氨酸Met(MMet(M)5.75)5.75„„苯丙氨酸苯丙氨酸Phe(FPhe(F)5.48)5.48脯氨酸脯氨酸Pro(PPro(P)6.30)6.30„„丝氨酸丝氨酸Ser(SSer(S)5.68)5.68苏氨酸苏氨酸Thr(TThr(T)6.53)6.53„„色氨酸色氨酸Trp(WTrp(W)5.88)5.88酪氨酸酪氨酸Tyr(YTyr(Y)5.65)5.65„„缬氨酸缬氨酸Val(VVal(V)5.97)5.97异亮氨酸异亮氨酸Ile(IIle(I))6.026.02按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类：按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类：中性氨基酸：中性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸（以上七种又称脂肪族氨基酸）、苯丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸（以上七种又称脂肪族氨基酸）、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸（这三种又称芳香族氨基酸）、蛋氨酸、胱酪氨酸、色氨酸（这三种又称芳香族氨基酸）、蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸（含硫氨基酸）、脯氨酸、羟脯氨酸（属亚氨酸、半胱氨酸（含硫氨基酸）、脯氨酸、羟脯氨酸（属亚氨基酸类）氨基酸类）酸性氨基酸：酸性氨基酸：天门冬氨酸、谷氨酸天门冬氨酸、谷氨酸碱性氨基酸：碱性氨基酸：赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸（二）氨基酸的分类酸性氨基酸pI2.8-3.2中性氨基酸pI5.0-6.3碱性氨基酸pI7.6-10.8（三）（三）氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质氨基酸分子中都具有氨基酸分子中都具有氨基和羧基氨基和羧基，，因此它们都能产生氨基与羧基的一般反因此它们都能产生氨基与羧基的一般反应，如应，如脂化、甲基化、乙酰化脂化、甲基化、乙酰化以及以及酸碱酸碱的中和的中和作用等。有些氨基酸由于存在其作用等。有些氨基酸由于存在其它基团而产生特殊反应，如半胱氨酸的它基团而产生特殊反应，如半胱氨酸的巯基（－巯基（－SH)SH)。。茚三酮反应茚三酮反应（四）氨基酸的分离分析（四）氨基酸的分离分析„„特殊沉淀法特殊沉淀法„„离子交换法离子交换法„„萃取法萃取法„„毛细电渗析毛细电渗析离子交换法分离分析氨基酸的原理离子交换法分离分析氨基酸的原理根据氨基酸是两性电解质这一特性，根据氨基酸是两性电解质这一特性，以及目的氨基酸与杂质氨基酸以及目的氨基酸与杂质氨基酸pKpK、、pIpI值值的差异，利用离子交换树脂对各种氨基的差异，利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同进行分离纯化。酸吸附能力的不同进行分离纯化。二、氨基酸分析仪二、氨基酸分析仪氨基酸分析仪的定义：氨基酸分析仪的定义：氨基酸分析仪进入国内市场已有近三十年氨基酸分析仪进入国内市场已有近三十年的历史，它是专用于测定蛋白质水解液（水解的历史，它是专用于测定蛋白质水解液（水解氨基酸）及生理体液中（游离氨基酸）混合氨氨基酸）及生理体液中（游离氨基酸）混合氨基酸含量的一种专用仪器，现已广泛应用于各基酸含量的一种专用仪器，现已广泛应用于各行各业。它与其它分析仪器区别在于行各业。它与其它分析仪器区别在于只能检测只能检测氨基酸氨基酸不能作为它用，具有专一性。从仪器的不能作为它用，具有专一性。从仪器的配置上来讲应配备专用的阳离子树脂氨基酸分配置上来讲应配备专用的阳离子树脂氨基酸分离柱、微量的输液系统、专用的检测器、反应离柱、微量的输液系统、专用的检测器、反应系统及符合国际、国内、涉外标准的检测方法系统及符合国际、国内、涉外标准的检测方法（离子交换柱后茚三酮衍生方法）。（离子交换柱后茚三酮衍生方法）。氨基酸分析仪基本分析原理氨基酸分析仪基本分析原理各种蛋白质都是由各种蛋白质都是由2020种氨基酸首尾相连，并以一定的种氨基酸首尾相连，并以一定的顺序组成肽链。用水解的方法将肽链打开，形成单一的氨顺序组成肽链。用水解的方法将肽链打开，形成单一的氨基酸进行分析。所有的氨基酸在低基酸进行分析。所有的氨基酸在低PHPH值的条件下都带有正值的条件下都带有正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。按照氨基酸分析仪设定氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。按照氨基酸分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、的洗脱程序，用不同离子强度、PHPH值的缓冲液依次将氨基值的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来（先酸性氨基酸再中性氨基酸酸按吸附力的不同洗脱下来（先酸性氨基酸再中性氨基酸最后碱性氨基酸），被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液最后碱性氨基酸），被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液在加热的条件下反应（在加热的条件下反应（135135度），生成可在分光光度计中度），生成可在分光光度计中570nm570nm和和440nm440nm检测到的蓝紫色物质（仲氨生成浅黄色物质检测到的蓝紫色物质（仲氨生成浅黄色物质440nm440nm检测检测))，外标法定量。，外标法定量。氨基酸分析仪洗脱过程氨基酸分析仪洗脱过程11..氨基酸氨基酸在在PH2.2PH2.2的条件下的条件下都带正电荷，在阳离子交换树脂上均都带正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附被吸附,,但结合强度各不相同。但结合强度各不相同。22..随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断地随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断地吸附、解吸附吸附、解吸附。。由于氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小）由于氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小）,,吸附强度吸附强度有差异。有差异。33..不同氨基酸与离子交换树脂的不同氨基酸与离子交换树脂的亲和力亲和力不同：不同：碱性氨基酸碱性氨基酸芳香芳香族氨基酸族氨基酸中性氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸及羟基氨基酸。酸性氨基酸及羟基氨基酸。4.4.提高流动相提高流动相PHPH值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离子交换柱上洗脱下来。子交换柱上洗脱下来。洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸基酸、碱性氨基酸。。55..氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上被洗脱的顺被洗脱的顺序一定序一定;;标准液各种氨基酸的浓度一定标准液各种氨基酸的浓度一定，洗脱峰的面积一定，洗脱峰的面积一定;;由此由此可计算出样品中各种氨基酸的含量。可计算出样品中各种氨基酸的含量。离子交换树脂离子交换树脂„„专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性阳离子交换树脂为柱填料。强酸型阳离子交换树阳离子交换树脂为柱填料。强酸型阳离子交换树脂，它是由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的。该树脂脂，它是由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的。该树脂是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成，球状树是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成，球状树脂的粒度一般在５～１０脂的粒度一般在５～１０μμｍ之间，交联度多为８ｍ之间，交联度多为８％～１２％。％～１２％。„„交联度大，树脂的网状结构紧密、孔隙度小，对外交联度大，树脂的网状结构紧密、孔隙度小，对外界离子进入树脂有阻碍作用，较大的离子根本不能界离子进入树脂有阻碍作用，较大的离子根本不能进入树脂内部，这样就可以提高树脂对离子的选择进入树脂内部，这样就可以提高树脂对离子的选择性。交联度大的适合用于分子量较小的氨基酸分性。交联度大的适合用于分子量较小的氨基酸分离；交联度小，树脂结构疏松、孔隙度大，适合用离；交联度小，树脂结构疏松、孔隙度大，适合用于蛋白质、肽类的分离。于蛋白质、肽类的分离。日立日立LL--89008900全自动氨基酸分析仪全自动氨基酸分析仪日立氨基酸分析仪的历史日立氨基酸分析仪的历史SoldKLAin1962KLA-5835L-8500四十多年的历史，拥有2000多用户L-8800L-8900LL--8900AAA8900AAA的内部结构的内部结构LL--8900AAA8900AAA的组成的组成组件名称组件名称参数参数缓冲液缓冲液66种（试剂与清洗液）种（试剂与清洗液）色谱柱色谱柱4.6mmidx60mm4.6mmidx60mm，，阳离子树脂填充（标配阳离子树脂填充（标配))泵泵0.0010.001--0.999ml/min,00.999ml/min,0--20MPa,220MPa,2自动进样器自动进样器15001500µµl;200vial(200cooler);0.1l;200vial(200cooler);0.1--100100µµll柱温箱柱温箱2020--8585℃℃（（11℃℃））,,电子加热电子加热//制冷的温控装置。制冷的温控装置。反应单元反应单元5050℃℃----140140℃℃,,电子加热的温控系统电子加热的温控系统检测单元检测单元可见分光光度计（可见分光光度计（570570，，440nm440nm））控制系统控制系统EZChromEZChromEliteElite分析软件分析软件CPU:32bitsOS,WindowsCPU:32bitsOS,WindowsxpxpLL--8900AAA8900AAA的分析原理的分析原理L-8900AAA的流程图1、样品中的氨基酸在低PH的条件下都带有正电荷,在阳离子交换树脂上均被吸附,但吸附的程度不同,碱性氨基酸结合力最强其次为中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。2、按照氨基酸分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、PH值的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来，3、分离后的氨基酸与茚三酮试剂在高温反应器中进行衍生反应，生成可以被分光光度计检测的有色物质，然后在检测器中被检测出来。LL--8900AAA8900AAA的性能指标的性能指标以蛋白水解液标准分析方法为例：以蛋白水解液标准分析方法为例：„„净分析时间：净分析时间：3030分钟分钟„„检出限：检出限：33pmolpmol(