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质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选、鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法5、掌握α互补筛选法的原理6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法二、实验原理:外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切酶切酶切酶切的载体分子和外源DNA分子连接连接连接连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基选择性培养基选择性培养基选择性培养基中培养，可以通过αααα互补筛选法互补筛选法互补筛选法互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切酶切酶切酶切电泳电泳电泳电泳及PCRPCRPCRPCR检验检验检验检验的方法进行重组子的鉴定。1.重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。（要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。）连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，用常用的连接时间为12-16h。2.感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的PUC19质粒在42℃下热击90s，实现转化。3.重组子的筛选鉴定重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR检测方法。抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，α互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。质粒PUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒PUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。质粒PUC19进入E.coliDH5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的E.coliDH5α，没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利用培养集中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PUC19乳糖利用基因内部，不能形成α-互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养。因为许多菌落存在假阳性情况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小，可将重组的载体DNA提取出来，进行后续的酶切、电泳检验。也以提取的重组质粒为模板，利用现有的引物，进行那个PCR扩增，检测个噢偶见的质粒是否是所期望的重组质粒。4.PCR技术PCR（Polymerasechainreaction）即聚合酶链式反应，其原理类似于DNA的体内复制，又叫做“体外基因扩增”。反应体系包括：模板DNA、寡核苷酸引物、Mg2+，4种脱氧核糖核酸（dNTP）、DNA聚合酶和合适的缓冲体系。反应基本程序包括DNA变性、引物复性及引物延伸三个基本过程。这三个反应构成一个循环，反复进行。每一轮循环扩增的产物可作为下一轮扩增反应的模板。理论上每一轮循环可使DNA数量增加一倍，反复30次，特异DNA序列片段以指数方式可扩增105~106。通过此技术可以使非常微量的DNA产生大量的PCR产物，因此这个技术是一项在体外大量生产目的基因的技术。现在普遍通用的是一种从水生嗜热杆菌中提取的TaqDNA聚合酶，而且大大提高了扩增片段的特异性、灵敏性和扩增效率。反应中用的引物有两段，一条称为上游引物或者正向引物，一条称为下游引物或者反向引物。引物的设计十分重要，在设计时应遵循以下原则：长度一般为18到24个碱基；G+C的百分含量在40%~60%；单条引物内部避免含有二级结构，避免形成引物二聚体；最好以1到2个G或C碱基开始或结束；引物的5’端可以被修饰，但是3’端绝对不能进行任何修饰，而且引物的3’端要避开密码子的第三位。模板的浓度不能太大，dNTP的浓度为2.5mmol/L，金属离子的浓度为1.5mmol/L，缓冲液为pH为7.2~8.0的Tris—HCl溶液。二、实验材料：1.菌株：E.coliDH5α2.培养基：LB培养基、麦康凯培养基（加入氨苄青霉素）3.试剂材料：酶切反应：（DNAPUC19质粒，酶切10×buffer，HindⅢ,重蒸水，λDNA。）连接反应：（酶切后的DNAPUC19质粒和λDNA，连接10×buffer，T4连接酶，重蒸水。）感受态细胞的制备：（0.1MCaCl2）转化：（连接液和感受态细胞，0.1MCaCl2，冰块。）重组菌的挑选、检验：试剂盒（含有RnaseA的溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，HBbuffer,DNAwashingbuffer，elutionbuffer）,酶切后的DNAPUC19质粒，试剂盒抽提的DNA，酶切10×buffer，HindⅢ,重蒸水，琼脂糖，TAE缓冲液。上样缓冲液，EB染液。PCR检测：10×PCRbuffer,dNTP,模板，引物1，引物2，水，TaqDNA聚合酶，琼脂糖，TAE、溴化乙锭（EB）4.仪器器材：20、200、1000ul的枪和枪尖，1.5ml的Ep管，恒温培养箱，水浴锅，平板，三角瓶，试管，接种环，牙签，酒精灯，火柴，冰箱，离心机，电泳槽，紫外仪，PCR扩增仪三、实验步骤载体与外源片段的酶切→连接→感受态细胞的制备→质粒转化与重组子的筛选→重组子的挑取与复证→重组质粒的提取与电泳检测→PCR检测（一）酶切1、在两支Eppendorf管中依次加入酶切反应的各种成分，混匀，适当离心，使样品集中于管底；酶切反应各成分添加如下：表1pUC19质粒及λDNA酶切反应体系目的DNA（λDNA）载体DNA（pUC19质粒）试剂体积/ul试剂体积/ulλDNA4.0pUC19质粒5.0Buffer1.5Buffer3.0ddH2O8.5ddH2O20.0HindⅢ核酸内切酶1.0HindⅢ核酸内切酶2.0加样次序：ddH2O、Buf、DNA、酶2、在37℃恒温水浴锅中反应1h以上。3.分别取上述酶切样品2~5uL，与1~2uL电泳上样缓冲液混合均匀，进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切反应是否彻底，剩余样品可以继续酶切。4.待电泳观察酶切反应完全后，将剩余样品从恒温水浴锅中取出，置65℃恒温水浴锅中保存10~15min，终止酶切反应5.样品可以直接进行酶切反应或者保存于-20℃冰箱备用（二）连接1、在Eppendorf管中依次加入连接反应的各种成分，混匀，适当离心，使样品集中于管底；连接反应各成分添加如下：表2连接反应体系试剂体积/ulλDNA/HindⅢ2.0pUC19DNA/HindⅢ2.010*LigaseBuffer1.0ddH2O4.0T4-DNA连接酶1.02、在16℃的恒温水浴锅中反应12-16h或者过夜；3、连接产物可用于转化实验。（三）感受态细胞的制备1、用接种环从含有E.coliDH5α的培养基平板上挑取少量灰白色E.coli菌落接种到20mlLB培养基里，37℃振荡培养过夜。实验均在无菌条件下，以防污染；2、取37℃过夜培养物，此时的培养物较浑浊，颜色变深。按1%的接种量吸取200μl转接到20mlLB培养基中，37℃振荡培养2.5~3小时；3.分别取1.5ml菌液于2个无菌的1.5mlEppendorf管中，5000rpm离心5min，弃上清液，吸干；重复收集菌体一次，使菌量增多；每支离心管中加入用冰预冷的1ml0.1mol/lCaCl2，漩涡震荡使细胞悬浮混匀，冰上放置15min，4℃5000rpm离心5min；4、弃上清液，吸干后，加入100ulCaCl2悬浮冰浴至使用；上述方法制好的感受态细胞置于冰上，48h之内均可用于转化，分装成2x50ul和100ul三管。（四）转化实验1、取制备好并摇匀后的3管感受态细胞悬液，分别作如下处理：（1）感受态细胞悬液50uL+pUC19质粒DNA1uL（2）感受态细胞悬液50uL+DH5a（3）感受态细胞悬液100uL+连接产物5uL2、将以上各样品管轻轻摇匀，冰浴10min，在42℃水浴中热击90s，然后迅速置于冰上2~3min，质粒已经