呼吸道病毒抗原筛查试剂盒(免疫荧光法)-说明书

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资源描述

呼吸道病毒抗原筛查试剂盒(免疫荧光法)说明书(供体外诊断使用)用途DHI直接荧光检测呼吸道病毒试剂盒是通过直接样本或细胞培养来定性鉴定常见的呼吸道病毒,流感病毒A,流感病毒B,副流感病毒1,2,3,以及呼吸道合胞病毒,腺病毒等。概述和说明为了更加快速和灵敏检测呼吸道病毒,合理区别使用各种抗生素,以及治疗流感的新抗病毒药物的使用,早期检测和辨别感染病毒变得非常重要。为了排除因细菌引起的呼吸道感染,病毒分离变得越来越重要。目前通过细胞培养和使用荧光单克隆抗体来进行病毒确认还是标准的鉴定方法。以下是7种常见的呼吸道病毒的特征:流感病毒A和B流感病毒(正粘病毒科)包含由八个分节的核糖核蛋白节段组成的一个单链RNA基因组。这种基因组分节在病毒中是很少见的,而且如果两种不同的病毒感染同一个细胞,可能会通过基因节段相互改变发展成新的病毒株。主要有三种流感病毒,分别是流感病毒A,B,C。流感病毒A主要宿主是鸟类,猪以及人类,然而B和C现在知道的主要是感染人。由于1918年流感病毒A引起的全世界大规模的流行病的爆发,导致2,500-3,500万人死亡,所以CDC和WHO一直都监控着流感病毒并预期通过合适的病毒株来生产疫苗。在美国,欧洲和日本,大约每年有1亿两千万人被流感病毒感染,而且据估计,每年在美国因流感病毒引起的肺炎导致75,000人死亡。病毒性肺炎或者细菌性肺炎是导致病毒感染死亡的主要原因。流感病毒A每10年到30年会大爆发一次,而且每年都会发生流感病毒A或B流行病。感染是季节性的,特别在北半球是从11月到4月容易爆发。小孩和老年人以及长期患有心血管肺炎的病人易于被感染。通过吸入空气中飞沫或者传染物仅经过1-3天潜伏期就会散播出去。主要症状表现为发热,肌痛,头疼和咽炎。以及被其他病毒双重感染,比如腺病毒。流感病毒A和B大多数是用A549/Mv1Lu混合物(R-Mix),RhesusMK,MDCK,MRC-5和A549细胞分离。腺病毒腺病毒(腺病毒科)是双链DNA无包膜病毒。总共有49种血清型,进一步被分成6组,从A到F,和绝大部分呼吸以及眼感染相关。一般上,成年人除了免疫系统受到损伤外,感染腺病毒的死亡率较低,但是会导致非典型肺炎。病毒一般是通过空气中飞沫和传染物传播,感染眼睛粘膜,呼吸道和肠道。腺病毒可以通过A549/Mv1Lumixtures(R-Mix),HEp2,HEK,A549andMRCcells分离。副流感病毒1,2和3副流感病毒(副粘病毒科)是单链的负链RNA包膜病毒。有4种类型,1到4,会引起5岁以下儿童喉炎和病毒性肺炎。成年人感染会引起上呼吸道疾病。副流感病毒是引起儿童下呼吸道疾病的第二大主因(第一是RSV)。由上呼吸道感染引起的IgA抗体的形成比血清IgG更具有保护性。因为IgA抗体不能通过胎盘,所以婴儿不能从母体中得到抗体,因此可能会在出生后第一或第二年被感染。副流感病毒感染爆发主要发生在隔年秋季或者一整年,春季会变得活跃。副流感病毒可以通过A549/Mv1Lumixtures(R-Mix),RhesusMK,MRCandLLC-MK2细胞分离。培养液中的胰酶有助于恢复1型和2型,但对3型没有帮助。呼吸合胞病毒(RSV)RSV(副粘病毒科)是单链的负链RNA包膜病毒。婴儿感染RSV会导致支气管炎,成年人感染会导致普通感冒。RSV通常是季节性的,易于在冬天和早春感染并引起多达5个月的流行期。死亡发生最高的是3-4个月大的婴儿。主要有两个亚型,A和B。B亚型主要特征是无症状和大多数人都会经历该感染。亚型A会导致更严重的临床疾病,在流行病爆发中占主导地位。RSV是导致婴儿和儿童下呼吸道感染的主要病毒。会发生再次感染但主要是限制在上呼吸道感染。RSV一般可以用免疫荧光试剂直接染色鼻咽上皮分泌物来直接进行检测,当然也可以通过A549/Mv1Lumixtures(R-Mix‘*),HEp2,Vero,LLC-MK2andMRC-5细胞培养来检测。检测原理DFA呼吸道病毒筛查和检测试剂盒用荧光直接标志的病毒抗原特异性的单克隆鼠抗体,快速筛查7种常见的呼吸道病毒。试剂盒包含7种病毒所有单克隆抗体混合装的筛查试剂。试剂盒可以用来直接样本检测或者细胞培养检测。提供材料呼吸道病毒DFA筛查试剂盒:10mL直接检测所有7种呼吸道病毒的单克隆荧光标记鼠抗体混合物。稳定的含有Evans蓝和0.1%叠氮化钠水溶解缓冲复染剂洗涤浓缩液25mL含有Tween20和0.1%叠氮化钠40x磷酸盐缓冲生理盐水浓缩液封闭液15mL含有0.1%叠氮化钠和稳定水溶解缓冲甘油自备材料:PBS:灭菌磷酸盐缓冲生理盐水用来冲洗和悬浮细胞丙酮:用来固定染色前的单层细胞,须使用99%纯度蒸馏水或软化水(demineralizedwater):用来稀释浓缩液,和当在聚苯乙烯多孔板中培养细胞时,用来稀释99%丙酮到80%。离心机:能产生700xg速度移液管抽吸装备镊子玻片盖玻片盖玻片吸纸冲洗废液容器固定容器荧光显微镜注意事项:仅用来体外诊断注意:1.标本必须按照1999年第4版的CDC生物医学和微生物的实验室生物安全规范操作手册推荐的任何潜在的感染人血清或血液样本必须在生物安全等级II的规定进行处理。2.假设所有的标本都是感染源,那么任何样本都可能含有致病源,必须小心不要和皮肤或者粘膜接触。在使用拭子,运送媒介物,细胞培养平板,试管,Shellvial等等过程中要小心,在进行处理前要消毒。3.在染色和储存过程中,避免试剂暴露于亮光下。4.不能使用过期的试剂和细胞来接种。5.使用其他试剂来替代那些试剂盒中特定的试剂,可能会产生错误的结果6.丙酮是不稳定,易燃溶剂。在通风区域使用,远离火源。7.试剂中含有0.1%叠氮化钠。使用大量的水冲洗到排污系统中,这样有助于阻止于金属管产生叠氮化金属物,当在高浓度时会可能引起爆炸。8.抗体试剂中含有的Evans蓝是潜在的致癌物质。避免皮肤接触,如果接触需用大量的水冲洗。储存说明不同成分的试剂储存条件不同抗体溶液,对照玻片和封闭液要储存在2-8℃洗涤浓缩液储存在2-30℃试剂制备洗涤液(使用时用1x):把25mL的40x洗涤浓缩液加入到1000mL的容器中,用975ml的蒸馏水或软化水混匀。在容器上标记成分和稀释时间,并在室温下保存。当溶液变得浑浊或者出现沉淀不要使用。标本收集,运送和储存因鼻咽上皮含有大量的上皮细胞,所有从鼻咽上皮抽吸物和洗涤分泌物是最佳的样本直接检测标本。用带有无菌,柔软的聚乙烯8号三通管抽吸收集器连接到吸引器上,来收集样本。当病人仰卧时,通过慢慢灌注和抽吸,把1-2ml的生理盐水灌入到病人的鼻孔中来收集洗涤物。抽吸也通过抽吸收集器连接到吸引器的方式进行。抽吸物和洗涤物必须用相同体积的,装在含有几个无菌玻璃珠子的离心管中的运送液来稀释。用拭子从鼻子,喉咙和鼻咽部提取分泌物经常不含有足够的上皮细胞,所以无法直接进行标本检测。标本必须在冰上运送到实验室,尽可能快速进行检测。避免对样本进行冻融,因为这样一来会使一些病毒丧失活性,导致检测灵敏性降低。检测前,样本储存在2-8oC不要超过48小时。如果需要储存更长的时间,样本需要储存在-70oC或者更低的温度。注意事项1.按照下面步骤推荐的体积和时间进行实验,以确保获得准确的结果。2.当用荧光试剂染色和用荧光显微镜检测细胞时,同时检测阳性和阴性对照是非常重要的,因为这样可以监测试剂性能和操作过程是否正确。建议检测每批病人样本时都进行对照检测。操作步骤:样本直接检测:固定样本步骤1.在漩涡混匀器上轻微混匀3下,见浑浊后去掉植绒拭子。2.2000转离心10分钟,3.弃去上清液(用于病毒分离鉴定),4.留约100-150µL上清液,吸管上下吹打混匀,形成混浊细胞悬浮液5.在玻璃片上点样,每个点加15ul细胞悬液。6.电吹风冷风下风干10-15min至干燥7.浸沫在冷丙酮溶液固定10min8.取出玻片,风干。DFA染色步骤1.在标本片和对照玻片的每个细胞点加上1滴相应的荧光抗体(约25ul)。2.在37℃湿盒孵育15-30分钟。3.PBS冲洗一遍,后浸没入PBS中洗两遍(PBS不能重复使用)。4.除去多余的洗液,每个细胞点加上1滴封闭液。最后覆上盖玻片。5.在荧光显微镜下观察结果。6.若不立即观察,4℃避光保存。免疫荧光显微镜检测法在检测样本前最好先检查阳性和阴性对照。如果其中有一个没有得到预期的结果,审查操作步骤和条件从而确认发生原因。不要进行样本检测直至得到正确的对照结果。荧光显微镜有三个方面原因会影响得到最亮的荧光:1.光源随着使用时间会降低耐久性,发出光降低会导致DFA产生较低的荧光强度。2.光源是通过许多透镜和反射镜聚集。为了获得最强荧光,这些透镜和反射镜必须排列正确。3.在光路中,必须使用正确的滤镜,本检测荧光是FITC。在检测细胞单层的荧光过程中,会有一些荧光假象存在:1.细胞碎片等会非特异性的吸收DFA’s,导致高强度的荧光产生。这些现象可以通过形态上进行区别,也就说,它们不会出现完整的一个细胞,特别不会出现像其他细胞那样的单层。2.低强度的黄绿荧光有时可能也会被看到,特别是当细胞重叠区域或者靠近单层细胞孔洞中。在这两种情况下,在洗涤过程中俘获的DFA’s发散光被阻碍,导致产生非特异性的荧光。3.因孵育时间过长或者湿度没有控制好,会导致在玻片四周出现密集荧光。4.去除粘层不充分,会导致非特异性的DFA’s吸收。5.洗涤不充分,会导致产生低度荧光因残留的DFA’s还是保留在单层细胞上。6.直接进行样本检测,要意识到白细胞和单核细胞会俘获荧光。同样,标本中的RBC(红细胞)也会产生朦胧的绿光。诊断原则与判断标准:诊断原则:FITC标记的某病毒特异性单克隆抗体与细胞中相应的病毒抗原结合后,形成抗原抗体复合物,荧光显微镜下细胞内显示苹果绿荧光。而未发生抗原抗体特异性反应的细胞,被Evans蓝染成红色。1.阳性结果判断:显示苹果绿荧光的细胞,为阳性细胞。当放大倍数为200倍时,在视野中找到≥2个阳性细胞,判为标本阳性。2.不同种类的病毒感染的细胞在染色上略有差异,具体情况如下,流感病毒A型/流感病毒B型:胞浆颗粒型;细胞核均质型。呼吸道合胞病毒:胞浆颗粒型,合胞体中亦可见小块包涵物染荧光。腺病毒:胞浆颗粒型;细胞核均质型。副流感病毒1/2/3型:胞浆颗粒型。注意事项1.在染色的整个过程中,勿使标本涂片干掉,以免造成严重的非特异性染色。2.荧光试剂需4℃避光保存,保质期内有效。3.标本点样及加抗体时,注意孔与孔之间勿要相互接触,避免交叉污染【生产企业】企业名称:DIAGNOSTICHYBRIDS,INC.地址:1055EastStateSt.,Suite100,Athens,Ohio,USA邮政编码:45701电话:001-740-5893382传真:001-740-5929820中国售后服务机构企业名称:上海贝西生物科技有限公司地址:上海市张江高科技园区蔡伦路720弄2号楼104室邮政编码:201203电话:021-51320493传真:021-50933599

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