新型基因工程亚单位菌苗对猪传染性胸膜肺炎的保护效力研究

中国农业科学2005,38(3):596-600ScientiaAgriculturaSinica收稿日期：2004-02-02基金项目：国家自然科学基金资助项目（30200011）和湖北省重点科技攻关项目资助（2001AA201B02）作者简介：刘建杰（1975-），男，河南濮阳人，博士，主要从事细菌分子生物学、基因工程疫苗方面的研究。E-mail:[e-mail]。陈焕春为通讯作者，Tel/Fax:[phone];E-mail:[e-mail]新型基因工程亚单位菌苗对猪传染性胸膜肺炎的保护效力研究刘建杰，陈焕春，李冲，何启盖，吴斌（华中农业大学动物医学院动物病毒室，武汉430070）摘要：利用分泌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ的重组表达产物和胸膜肺炎放线杆菌7型菌，研制了一种新型的基因工程亚单位菌苗并对此疫苗的免疫效力进行了研究。利用该疫苗免疫断奶仔猪，间隔3周加强1次，同时设空白对照组和一种商品化的三价细菌灭活苗组。首免后每周采血检测ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ的ELISA抗体和7型菌的血凝抗体，第2次免疫两周后用猪胸膜肺炎放线杆菌1型菌株进行气管攻毒。从攻毒后症状、细菌分离、抗体检测、死后剖检对免疫效果进行评价。结果显示亚单位菌苗对于猪传染性胸膜肺炎有显著的保护力，能明显减轻临床症状和降低肺部损伤，效果优于商品化的细菌灭活苗。关键词：亚单位菌苗；细菌灭活苗；抗体；保护效力StudyontheProtectiveEfficiencyoftheGeneticSubunitBacterinAgainstPorcineContagiousPleuropneumoniaLIUJian-jie,CHENHuan-chun,LIChong,HEQi-gai,WUBin(LaboratoryofAnimalVirology,CollegeofVeterinaryMedicine,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070)Abstract:TheefficacyofanewgeneticsubunitbacterincontainingrecombinantApxtoxinsandserovar7ofActinobacilluspleuropneumoniaewasdetermined.Weanedpigletswerevaccinatedtwiceintramuscularlywiththenewgeneticsubunitbacterinorcommericaltrivalentformalin-inactivatedA.pleuropneumoniae.Theantibodyofeachantigenwasdetectedeachweekafterfirstimmunization.Pigletswerechallengedbypercutaneousintratrachealinjectionwithserovar1.Theprotectiveefficacyofimmunizationwasevaluatedbyclinical,bacteriological,serologicalandpost-mortemexamination.Theresultssuggestthatimmunizationwithsubunitbacterincouldreduceclinicalsignandlunglesion,whichismoreefficaciousthanbacterins.Keywords:Subunitbacterin;Commercialbacterin;Antibody;Protectiveefficacy猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae，APP）引起的一种高度传染性呼吸道疾病，以急性出血和慢性纤维素性胸膜肺炎为特征，近年来给世界各地的养殖业造成了严重的经济损失。该病的病原菌血清型多，不同血清型间没有交叉保护力，因而高效疫苗的研制成为控制此病的关键。目前使用较多的疫苗有灭活菌苗和不同成分混合制成的亚单位疫苗。其中普通灭活菌苗不能阻止肺部病变的形成与慢性感染，也不能对异型菌的感染提供有效的交叉保护[1,2]。APP毒力因子很多，包括荚膜、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、及分泌毒素（Apx）等，其中分泌毒素是APP最主要的毒力因子，同时也是APP最重要的保护性抗原，对于不同血清型之间的交叉保护起着重要的作用，是高效疫苗不可或缺的成分[3，4]。在细菌灭活菌苗中加入细菌产生的Apx后，疫苗的保护力大为提高，主要成分为毒素的亚单位疫苗对动物的保护力优于缺少Apx毒素的商业灭活苗[5~7]。和亚单位疫苗相比，细菌灭活苗可以向免疫系统3期刘建杰等：新型基因工程亚单位菌苗对猪传染性胸膜肺炎的保护效力研究597提供更多的抗原性物质。鉴于APP的分泌毒素不是惟一的致病因子，笔者设想利用中国流行的APP7型菌株，加入Apx来提高传统灭活疫苗的效力，研制高效的具有交叉保护力的疫苗。由于提取天然Apx的方法不易实现大规模的生产且成本较高，因而笔者利用基因工程的方法，实现了APP3种毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ在廉价的原核表达系统大肠杆菌内的高效表达。利用表达毒素和7型菌制成亚单位菌苗免疫小鼠后，攻毒对于同型和异型菌的保护力分别为91.7%和83.3%，效果优于传统的灭活苗（结果尚未发表）。在此基础上，提取表达产物，和7型菌混合乳化制成亚单位菌苗免疫仔猪，之后进行攻毒，探讨此种亚单位菌苗对猪只的保护效力。1材料与方法1.1菌株及主要试剂试验所用APP菌株，由华中农业大学动物医学院动物病毒实验室鉴定保存；表达ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ的BL21（DE3）菌株由该实验室构建。油乳佐剂亦由该试验室提供；SKL（N-lanraylsarcosineNaSalt,十二烷基肌胺酸钠）购自sigma公司，IPTG购自Promega公司，辣根过氧物酶标记的羊抗猪IgG购自SouthernBiotech公司。1.2疫苗制备3种毒素的包涵体按实验室常规方法提取，纯度用SDS-PAGE电泳鉴定，蛋白质浓度用紫外分光光度计测定。APP7型菌的培养按实验室常规方法进行，培养后离心，加入甲醛磷酸盐缓冲液进行灭活。之后把灭活好的APP7型菌和3种毒素的包涵体按一定的比例混合，进行乳化制苗，称为亚单位菌苗。普通三价细菌灭活苗由市场购买。1.3试验动物及免疫分组5周龄断奶仔猪，共12头，购自湖北省某规模化猪场，利用流行病学调查、间接血凝和ApxⅡELISA抗体检测方法检测确定为猪传染性胸膜肺炎阴性猪。随机分成3组，其中空白对照组4头，免疫乳化的PBS缓冲液；亚单位菌苗组4头，免疫笔者自行研制的亚单位菌苗；细菌灭活苗组4头，免疫市场上购买的普通三价细菌灭活苗。1.4抗体的检测毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的抗体按文献［8］自行建立ELISA方法进行检测。选用适宜的培养基培养APP3型、7型、10型菌株，利用饱和硫酸铵沉淀的方法，分别提取培养物上清中的毒素ApxⅢ、ApxⅡ、ApxⅠ，和猪阴阳性血清进行方阵滴定，确定最佳抗原包被浓度、最佳血清稀释度。之后用确定的最佳条件包被96孔聚苯乙烯ELISA板检测免疫后采集的猪血清毒素抗体效价；7型菌的抗体按间接血凝的方法进行检测，以血清效价大于等于1:16判为阳性[9]。抗体的检测及免疫时间的安排：从0天开始首免，3周后加强免疫，试验期间从第1周到第5周每周对试验猪前腔静脉采血检测抗体效价，第5周进行攻毒，攻毒前两天开始测量体温，持续到第6周试验结束。1.5疫苗效力的观测第2次免疫2周后，参照文献[13]的攻毒剂量进行气管攻毒。攻毒后1周内观察猪只的食欲、呼吸频率、呼吸强度、精神状态等情况，并于攻毒前两天及攻毒后1周每天下午3点钟测量猪只直肠温度。攻毒1周后处死所有存活猪只，观察肺部病变情况并进行细菌的分离鉴定。2结果与分析2.1毒素包涵体的提取按照实验室常规的方法提取包涵体，进行变性和复性后，取少量进行SDS-PAGE电泳以检测其纯度。结果如图1，箭头所指的分别为ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ，其中ApxⅠ大小为105～110kD，ApxⅡ大小为103～105kD，ApxⅢ大小约为120kD。2.2毒素抗体水平的测定按照最佳抗原包被浓度、最佳血清稀释度和最佳的辣根过氧物酶标记的羊抗猪IgG浓度包被聚乙烯ELISA板进行毒素抗体的测定。图2表示的是从第一次免疫到攻毒之间每周采集的血清所测的3种毒素的抗体效价OD值。从图中可以看出，对照组的毒素抗体水平维持在一个很低的水平，和笔者免疫前检测的抗体相比，基本没有什么变化。普通细菌灭活苗组的毒素抗体水平不一，ApxⅡ抗体效价最高，ApxⅢ次之，而ApxⅠ基本没有什么抗体，分析其原因，该灭活苗中的细菌为1、3、7型菌，这3种细菌均可产生ApxⅡ，3型菌可产生ApxⅢ，而1型菌虽可产生ApxⅠ，但在生长过程中需要Ca2＋的诱导才能产生，而据笔者了解该疫苗生产过程中并没有加入Ca2＋，因而可能疫苗中根本不含ApxⅠ，因而检测不到抗体。而笔者自行研制的亚单位菌苗，从第1次免疫到第2次免疫，598中国农业科学38卷1.ApxⅠ；2.ApxⅡ；3.ApxⅢ图1表达毒素包涵体的SDS-PAGE结果Fig.1TheresultsofSDS-PAGEoftheexpressedApxinclusionbody毒素抗体逐渐升高；特别是第2次免疫后毒素抗体效价迅速升高，并维持在一个较高的水平，2免后2周抗体效价相差不大。由于毒素能直接杀灭宿主肺内的巨噬细胞和损害红细胞，是引起感染肺严重病损的主要原因[10]，因而毒素的抗体对于肺部病变的损伤有很好的保护作用，这可能也是攻毒后亚单位菌苗肺部损伤轻微，而且没有出血现象的原因。2.3血凝抗体水平的测定按照中国农业科学院兰州兽医研究所的间接血凝检测方法对菌体的血凝抗体进行了测定（表1）。由表1可以看出，对照组基本没有血凝抗体，而亚单位菌苗组和细菌灭活苗组总的来说抗体呈上升趋势，但可能结果判定有时带有主观性或者是检测方法本身的原因，不呈明显的递增趋势。但从表中可以看出，亚单位菌苗组的抗体水平上升的较普通灭活苗组高，这可能和疫苗中细菌含量有关，细菌含量高的疫苗间接血凝抗体水平较高，因为间接血凝检测的是菌体抗原。2.4攻毒后的保护效力攻毒情况见下表（表2），其中猪只体温升高0.5～2℃不等（数据没有给出），笔者对于猪只攻毒后的临床症状、死亡情况、剖检肺部变化及肺部细菌的分离图2毒素ELISA抗体检测结果Fig.2TheantibodylevelofApxs（meanOD630）表1间接血凝抗体结果Table1TheresultsofIHAIHAPigNo.免疫前Beforevaccination第1周1stweek第2周2ndweek第3周3rdweek第4周4thweek第5周5thweek1－－1︰21︰41︰2－2－－－1︰2－－31︰41︰81︰41︰21︰41︰4对照组Control41︰21︰41︰41︰21︰41︰21－1︰81︰161︰161︰321︰3221︰41︰161︰161︰161︰321︰323－1︰161︰161︰161︰321︰64普通灭活苗组Commercialbacterin41︰41︰161︰161︰161︰321︰6411︰21︰161︰321︰321︰641︰12821︰41︰321︰321︰321︰641︰12831︰21︰161︰321︰321︰321︰64亚单位菌苗组Subunitbacterin4－1︰161︰161︰321︰321︰643期刘建杰等：新型基因工程亚单位菌苗对猪传染性胸膜肺炎的保护效力研究599鉴定情况做了总结。对照组两头猪是在24h内死亡，而普通灭活苗组的一头是在36h内死亡，都出现了典型的急性胸膜肺炎症状，可以看出攻毒剂量还是比较大的